舌癌细胞成像中的上转换发光材料

2017-02-14徐亚娟金志巍张艳秋刘文书

中国老年学杂志 2017年2期

关键词：纳米材料探针粒子

徐亚娟陈蕊金志巍张艳秋刘文书

(吉林省肿瘤医院口腔颌面肿瘤外科，吉林长春 130012)

舌癌细胞成像中的上转换发光材料

徐亚娟陈蕊金志巍张艳秋刘文书1

(吉林省肿瘤医院口腔颌面肿瘤外科，吉林长春 130012)

目的探讨上转换发光材料在舌癌细胞成像中的应用价值。方法采用 MTT 法对上转换稀土发光纳米探针进行细胞毒性分析。将胺基修饰过的上转换发光纳米探针皮下注射到裸鼠腋下肿瘤处，对裸鼠进行 CT 检测。合成上转换发光纳米分子探针，对其进行表征及胺基修饰，并进行红外光谱分析。结果采用水热法制备得到粒子大小均一的上转换发光纳米材料NaYF4。上转换纳米材料能激发深层生物组织信号，具有很深的激发光穿透能力，避免了对组织、细胞的损伤。它具有的良好生物相容性，较小毒副作用，荧光寿命长，有多个发射峰且发射谱带窄的特点，有利于进行多重生物组织的标记成像。结论上转换发光纳米探针能在癌细胞成像，为进一步上转换发光的纳米探针的临床应用奠定理论基础。

上转换发光纳米探针；细胞成像；胺基修饰；CT检测

早期预警对舌癌的诊断及治疗至关重要，目前，常用的生物检测手段有磁共振成像(MRI)、正电子发射计算机、电子计算机、光学成像、CT、PETCT横断扫描等，但效果均不理想〔1〕。上转换发光是一种在近红外光激发下能发出可见光或紫外光,它可以吸收两个或两个以上低能光子而辐射一个高能光子的发光现象〔2〕。无机基质材料的稀土离子上转换发光材料具有较长的能级寿命、较高的上转换发光效率，是目前研究较多且比较理想的上转换材料。经常使用Yb3+离子进行共掺杂可提高其发光率。稀土离子Yb3+的吸收光谱峰值在980 nm，与Er3+第一激发态的吸收能量相一致，且吸收截面远>Er3+,吸收完能量后可直接传递给Er3+，因此是一种很有效的上转换敏化剂〔3〕。

本研究合成了氨基修饰的纳米材料上转换纳米材料，具有优良的 UCL 性质，氨基不仅极大地增强了上转换发光纳米粒子核的荧光强度，还能够使纳米探针更容易与目标细胞结合，形成细胞成像。通过荷肿瘤裸鼠的活体实验，证明了氨基修饰的上转换发光纳米粒子能在舌癌细胞中成像，为纳米探针的临床应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料人舌鳞癌细胞(Tca-8113)、稀土氧化物(氧化钇(Y2O3)、氧化镱(Yb2O3)，氧化铒(Er2O3)、氧化钆(Gd2O3)、DMEM、胎儿牛血清蛋白(FBS)、溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)。其他试剂均为国产分析纯试剂。实验用水为去离子水，除特殊说明外，实验均在室温下进行。

1.2 实验方法

1.2.1 上转换发光纳米粒子的合成将Y2O3、Yb2O3和Er2O3分别溶于过量的HCl中加热蒸干，然后再加入适量水配制成1.6 mol/L YCl3，0.1 mol/L ErCl和30.6 mol/L YbCl3的水溶液作为储备液。接着分别提取0.5 ml YCl3、30.3 ml YbCl3和0.2 L ErCl的储备液加入到容量为100 ml的三口烧瓶中，搅拌均匀后逐渐加热升温至100℃后蒸干水分，再加入6 ml油酸和15 ml 1-十八烯，继续升温达到150℃。观察反应混合物形成均匀的淡黄色溶液后，再冷却至室温，并逐滴加入2.5 mmol NaOH 的甲醇溶液10 ml和含有 4 mmol NH4F，均匀搅拌1 h后升温逐渐达到70℃，然后进一步排尽甲醇，再升温至100℃，缓慢升温至300℃。在 300℃下孵育1 h后，再冷却到室温。最后以乙醇为洗涤液，在10 000 r/min离心洗涤3次；最后将所获得的NaYF4∶Yb3+,Er3+纳米粒子重新分散于5 ml环己烷中，待用。

1.2.2 上转换发光纳米粒子的胺基修饰方法将NaYF4纳米粒子置于环己烷溶液中，与8 ml盐酸溶液混合搅拌过夜，去掉纳米粒子表面的配体，由-OH配位，加丙酮20 ml，8 000 r/min离心8 min，用水分散加丙酮沉化，11 500 r/min离心20 min，重复2次；加入到配置的750 mg聚丙烯酰胺(PAAM)20 wt%水溶液并分散于50 ml水的水溶液中，搅拌过夜；之后11 500 r/min离心15 min，重复3遍，得到的沉淀分散在8 ml二甲基甲酰胺(DMF)或者水中。

1.2.3 MTT细胞毒性实验用含10%FBS DMEM，5% CO2、37℃下培养人舌鳞癌细胞(Tca-8113细胞)。将细胞密度为1×105细胞/孔的Tca-8113细胞悬浮液接种到48孔板中培养，用 0.05 mol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.2)清洗细胞3次；分别加入 50 μl(0.31，0.63和1.25 g/L) 不同浓度的NaYF4∶Yb3+，ER3+纳米探针和50 μl(0.31、0.63和1.25 g/L) 不同浓度的胺基修饰过的NaYF4∶Yb3+，ER3+纳米探针，以及 100 μl新鲜 DMEM共孵育24 h。

1.2.4 CT造影成像实验取1 ml(0，0.31，0.63，1.25 和2.50 g/L)不同浓度的胺基修饰的纳米探针水溶液分别加入EP离心，利用螺旋CT(GE64排)对纳米探针图像采集(成像参数：Thickness=0.1 mm；Pitch=0.648；120 kVp，192 mA；Field of view=108 $108；Matrix=1 024 $1 024 pixels;Gantry rotation time=0.75 s；Table speed=16.7 mm/s)。

1.2.5 裸鼠的活体 CT 成像先将150 μl水合氯醛溶液(10%，1∶1) 注入种植有腋下肿瘤的裸鼠，在肿瘤区皮下注射150 μl胺基修饰的纳米探针溶液；在不同的时间点对裸鼠进行 CT 成像(成像参数:TR/TE=1 000，2 000，3 000，4 000/7.9 ms;Field of view=8 cm;Matrix=128 $128;number of excitations(NEX)=2;Slice thickness=2 mm;Space=0.5 mm;Coil=QUADKNEE)。

2 结果

2.1 上转换发光纳米探针的表征上转换发光纳米粒子在原子力显微镜下观察，纳米粒子大小均一，平均粒径为(240±1.2)nm。如图1A 所显示NaYF4∶Yb3+，Er3+纳米粒子为球形。胺基修饰之后，纳米粒子的粒径相应的增加到(400±3)nm (如图1B所示)。

A：未修饰的纳米粒子；B：胺基修饰的纳米粒子图1 上转换发光纳米粒原子力显微镜图

2.2 红外光谱对上转换发光纳米探针检测对上转换发光纳米探针进行胺基修饰，为检测纳米探针胺基的存在，通过红外光谱对此法合成的胺基修饰前后的NaYF4纳米粒子进行表征。油相制备的NaYF4∶Yb3+,Er3+纳米粒子谱线中2 754 cm-1和2 853 cm-1来自于C-H键的伸缩振动，利用PAAM(聚丙烯胺)相转移之后的样品中，同时1 157 cm-1的吸收峰来自C-H的伸缩振动，而1 472 cm-1和1 659 cm-1的吸收峰来自N-H的变形振动，出现这些新的振动峰足以证实PAAM配体对上转换纳米粒子的修饰是成功的，见图2。胺基能与含有羧基的生物分子(如抗体，蛋白、氨基修饰等)反应，为纳米探针的进一步生物应用，如药物负载、癌症的靶向治疗等提供可能性。

用980 nm波长的激光照射分散在血清细胞生长培养基的胺基修饰过的纳米探针，在暗室内，能观察到稳定均一的光束。实验表明胺基修饰的上转换发光纳米探针在DMEM细胞培基中具有良好的分散性和稳定性。

2.3 上转换发光纳米探针的细胞毒性检测实验利用体外细胞毒性实验对纳米探针进行细胞毒性检测，评价上转换发光纳米探针的在接触细胞后所产生的生物学反应。实验设立了三组浓度梯度，通过MTT实验检测细胞的成活数(图3)。在三组实验浓度下Tca-8113存活率都在90%以上(见表1)。

图2 胺基修饰的上转换发光纳米粒的红外光谱图

图3 MTT细胞毒性实验数据

利用获得OD值计算三组实验浓度下Tca-8113存活率都在90%以上(见表1)。Tca-8113与浓度高达 2.5 g/L 的上转换发光纳米探针共培养24 h后仍保持高于90%的存活率，说明纳米探针具有较低的细胞毒性。实验结果表明：不同浓度梯度的纳米探针NaYF4∶Yb3+,Er3+,和胺基修饰过的NaYF4∶Yb3+,Er3+纳米探针，对细胞的毒性都很小。

2.4 上转换发光纳米探针的磁共振特性检测为了验证胺基修饰过的上转换发光纳米探针是否具有磁共振(MR)特性能，并够提高 MRI的造影效果。以及胺基修饰的上转换发光纳米探针是否具能在细胞内成像，利用GE64排螺旋CT系统对纳米探针进行CT图像采集，检测合成的探针在CT造影的稳定性。实验结果表明在kOe(1 Oe=41π103 A/m)的磁场下，胺基修饰的NaYF4∶Yb3+,Er3+纳米探针具有CT信号，且CT信号与纳米探针的浓度成正比。实验将10 g/L胺基修饰过的上转换发光纳米探针皮下注射到裸鼠腋下肿瘤处；分别在注射前和注射后30 min对裸鼠进行CT 检测，观察发现纳米探针对肿瘤区的信号有明显的增强效果。在注射纳米探针前肿瘤区的CT 信号值为42，而注射30 min后肿瘤区明显变亮(见图4)，其CT信号值增加到314，证明胺基修饰过的上转换发光纳米探针具有较强的 CT 造影能力。实验结果表明：胺基修饰过的上转换发光纳米探针能够作为纳米探针应用于CT活体成像。

表1 不同浓度梯度的细胞活性

1：未注射上转换发光纳米探针图像；2：注射胺基修饰过的上转换发光纳米探针30 min 后图像图4 下肿瘤的裸鼠进行 CT成像

3 讨论

上转换发光材料在生物成像方面具有巨大优势，这种材料具有很强的荧光效率，比较理想的光稳定性和抗漂白性，和非常完美的性价比。上转纳米材料通常以近红外光(一般为980 nm)为激发光源，这使得它具有很强的穿透能力，对组织的损伤较轻而且组织不会产生自发荧光。这些优点使上转换发光纳米材料成为继量子点后，又一应用性强荧光探针〔4〕。同时上转换稀土纳米材料也是一种理想应用方向的纳米造影剂，如果掺杂了适当的稀土元素，能使其具备上转换荧光(UCL)的特性和 CT造影的能力。采用980 nm 成像技术、近红外激光激发的UCL，更具有强的穿透力且无任何干扰、背景低等优点，能从紫外区跨度到红外区，使成像的选择能力有所提高〔5〕。1999年Zijlmans等在首次报道了上转换荧光材料检测人类前列腺组织中特异性抗原，使得上转换纳米材料广泛应用于各种生物检测和分析〔6〕。有研究报道了一种新颖的上转换纳米材料检测方法，用Yb3+，Er3+一同掺杂到上转换纳米颗粒做成生物探针对溶液中痕量进行分析和检测〔7〕。

上转换纳米稀土发光材料(UCNPs)是可发出反斯托克斯光、将光子能量转换升高同时也可将近红外光转换成可见光的功能性材料〔8〕，其最大特点是在能量上吸收光要远小于发射光〔9〕。本论文采用水热法制备得到粒子大小均一的上转换发光纳米材料NaYF4，对上转换发光纳米探针进行胺基修饰，为检测纳米探针胺基的存在，通过红外光谱对此法合成的胺基修饰的NaYF4纳米粒子进行表征，通过胺基与含羧基的生物分子反应为纳米探针的进一步生物应用提供可能性。虽然有文章报道了 UCNPs 在细胞水平有限的毒性〔10〕，但是在合成上转换纳米稀土发光纳米探针避开了有毒的成分，并通过MTT法进行细胞毒性检测，没有观察到有明显的抑制生长的现象。同时运用上转换稀土发光材料对裸鼠进行 CT 检测，证实纳米探针具有识别舌癌细胞区的信号效果。综上，实验证实上转换发光纳米材料在生物诊疗方面独特的性质和优势，具有良好相容性，能够作为一种舌癌肿瘤标记、追踪与检测的材料，在未来的生物医学肿瘤诊治方面有着广阔的应用价值。

1 高硕辉,柳扶摇,张卜天,等.NaYF4∶Yb3+,Er3+@NaGdF4@TaOx多模态纳米探针的合成及其在生物成像中的应用〔J〕.分析化学，2013；41(6)：811-6.

2 姜桂铖.稀土掺杂光谱转换材料及其生物荧光探针应用〔D〕.合肥：中国科学技术大学，2012.

3 张向华,李立,龚军辉,等.CaO对提高Er3+/Yb3+共掺ZrO2上转换发光效率的研究〔J〕.硅酸盐通报,2011;30(6):1386-409.

4 马玉润.Yb,Er掺杂的NaYF4上转换纳米材料的制备和发光性能的研究〔D〕.上海：上海师范大学,2015.

5 刘波，胡丹，刘玉萍，等.上转换发光纳米材料在生物成像中应用的研究进展〔J〕.科学通报,2013;58(7):517-23.

6 周进.功能化碳纳米材料的制备及其荧光性能研究〔D〕.杭州：浙江师范大学,2013.

7 马小媛,李双,吴世嘉,等.基于上转换荧光标记和磁分离技术的沙门氏菌DNA检测新方法〔J〕.食品与生物技术学报,2013;32(12):1303-10.

8 汪超.稀土上转换发光纳米材料在肿瘤治疗与生物影像检测方面的应用〔D〕.苏州：苏州大学,2014.

9 胡鹤.稀土上转换发光纳米材料的制备及其在生物医学成像中的应用〔D〕.上海：复旦大学,2009.

10 宋凯,杜创,赵军伟,等.NaYF_4:Yb～(3+),Er～(3+)发光上转换纳米晶的表面修饰及其生物效应〔J〕.发光学报,2012;33(11):1215-8.

〔2015-12-19修回〕

(编辑袁左鸣)