APP下载

产气荚膜梭菌β1毒素基因克隆与表达

2017-02-13张蓉蓉艾地云张腾飞罗青平

湖北畜牧兽医 2016年9期
关键词:梭菌产气质粒

张蓉蓉++艾地云++张腾飞++罗青平++温国元++王红琳++汪宏才++邵华斌

摘要:以C型产气荚膜梭菌中PCR扩增出β1毒素基因,构建了表达质粒pGEXKG-β1,将构建的KG-β1转化受体菌BL21(DE3),得到重组菌株BL21/KG-β1。对重组菌株诱导的表达产物进行了SDS-PAGE分析,结果表明重组菌株可以高效表达毒素蛋白。

关键词:产气荚膜梭菌;β1毒素;克隆表达

中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1007-273X(2016)09-0007-02

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)在自然界中广泛分布,是人和动物肠道内的一种正常菌,能产生a、β、ε、ι四种主要毒素,根据产生这四种毒素种类的不同,可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五种类型[1]。该菌在家禽中主要是能引起坏死性肠炎,鸡源产气荚膜梭菌主要是A型,但也有C型,C型产气荚膜梭菌主要产生a和β两种毒素。其中β毒素具有细胞毒性和致死性的特点,是重要的致病因子[2]。课题组在前期进行了鸡源产气荚膜梭菌a毒素的克隆表达及免疫原性研究[3],本研究旨在进一步对β毒素进行克隆表达,为其诊断试剂和亚单位疫苗的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 C型产气荚膜梭菌、受体菌大肠杆菌DH5a和BL21(DE3)和pGEX-KG载体由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶BamH I和Xho I、PCR试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司;RNaseA、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司;细菌DNA提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 参照NCBI中产气荚膜梭菌β1毒素全基因组序列,设计1对β1毒素基因引物,上游引物CPb01: 5′-ACGGGATCCTTAGTTATAGTTAGTTCACTTT-3′,下游引物CPb02:5′-ACGCTCGAGCTAAATAGCTGTTACTTTATG-3′,目的片段大小为1 008 bp,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。上游引物和下游引物分别含有BamH I和Xho I酶切位点。

1.2.2 全基因组的提取 将产气荚膜梭菌在厌气肉肝汤中于37 ℃厌氧培养过夜离心后,将沉淀菌细胞重悬于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中,混匀后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit说明书进行全基因组的提取。

1.2.3 PCR扩增 50 μL PCR反应体系为:10×Buffer缓冲液5.0 μL,MgCL2(25 mmol/L)4.0 μL,dNTPs(10 mmol/L)1.0 μL,模板5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL和Taq DNA聚合酶(25 U)1.0 μL,加灭菌双蒸水补足至50 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35个循环;72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

1.2.4 PCR产物的回收、连接转化及鉴定 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳回收后,以DNA胶回收试剂盒回收PCR产物,按说明书操作。将回收纯化的目的产物与pGEX-KG载体双酶切后,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,以含有氨苄西林(Amp)抗性平板进行筛选培养,挑取白色菌落于含Ampr的LB液体培养基上培养过夜,以SDS碱裂解法提取重组质粒,经PCR鉴定及BamH I和Xho I双酶切分析筛选阳性克隆。

1.2.5 阳性质粒的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析 将构建的阳性质粒转入受体菌BL21(DE3)经37 ℃加IPTG诱导后,按文献[4]报道的方法收集菌体变性处理后,进行SDS-PAGE电泳分析。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定结果

采用设计的特异性引物进行β1毒素基因的PCR扩增,经1%琼脂糖凝胶电泳,结果表明,以产气荚膜梭菌为模板扩增出约1 000 bp的特异性条带,与预期大小相符(图1)。

2.2 重组质粒的双酶切鉴定

将质粒经PCR鉴定后用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切鉴定,结果见图2。由图2可见,经双酶切后可获得大小约为5 000和1 000 bp的2条DNA条带,即pGEX-KG载体和目的基因条带,初步表明成功构建产气荚膜梭菌β1毒素克隆表达质粒。

2.3 β1毒素基因表达产物SDS-PAGE分析

将BL21(DE3)菌株作为表达的宿主菌,经转化挑取单个菌落培养诱导后,菌体经超声波处理,提取包涵体,上清经80%饱和硫酸铵沉淀后得到浓缩,沉淀经透析后,用SDS-PAGE分析(图3),在相对分子质量约为56 ku处出现特异性蛋白条带,结果表明β1毒素可在宿主菌种得以表达,并且β1毒素蛋白多以包涵体的形式存在表达。

3 讨论

产气荚膜梭菌能产生多种具有致病性的外毒素,其中β毒素不仅能引起家禽坏死性肠炎及仔猪肠毒血症,也能引起婴幼儿的坏死性肠炎[5],危害极其严重。本研究利用PCR技术,设计特异性引物成功地从C型产气荚膜梭菌中扩增出目的片段β1,并构建了成功表达β1毒素的重组菌株,表达的蛋白以包涵体形式存在,纯度高。β1毒素的表达为产气荚膜梭菌的临床诊断和基因工程疫苗提供了前提。

参考文献:

[1] SPARK S G, CARMAN R J, SARKER M R,et al. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39(3):883-888;

[2] TIMBERMONT L, LANEKRIET A, PASMANS F,et.al. Intra-species growth- inhibition by Clostridium perfringens is a possible virulence trait in necrotic enteritis in broilers[J]. Veterinary Microbiology, 2009(12):l-4.

[3] 张蓉蓉,艾地云,张腾飞,等. 鸡源产气荚膜梭菌a毒素基因克隆表达及免疫原性的初步研究[J].湖北农业科学,2015,54(20):5152-5154.

[4] 梁宋平.生物化学与分子生物学实验教程[M].北京:高等教育出版社,2003.

[5] GRANUM P E. Clostridium perfringens toxin involved in food poisoning[J]. Int J Food Microbiol,1990,10:101-111.

猜你喜欢

梭菌产气质粒
动力电池产气分析技术的研究与展望
丁酸梭菌在畜禽生产中的应用
开发新方法追踪植物病害的全球传播(2020.6.7 iPlants)
小鼠转录因子STATl真核表达质粒的构建及生物学功能分析
一种脂肪酸可有效对付艰难梭菌
改进模型构建 实现教材二次开发
沼液絮凝上清液预处理对甜高粱秸秆厌氧发酵特性的影响
一例延边奶山羊梭菌病的病理学观察
我国首次海域可燃冰试采结束并关井
梭菌对养猪生产的危害及防治