牛支原体湖北株的分离鉴定及其oppF基因的进化分析

刘威++袁芳艳++周丹娜++刘泽文++杨克礼++段正赢++郭锐++吴修竹++田永祥

摘要：牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起犊牛肺炎、关节炎和成牛乳房炎的主要病原之一。从湖北恩施暴发牛支原体的肉牛场（70头引种肉牛出现20%的死亡）分离得到一株牛支原体，命名为HB2015，并对其进行了保藏（保藏号：CCTCC M 2016559），进化分析结果显示该菌株与M. bovis NM2012内蒙株亲缘关系较近，为牛支原体的防控提供了理论依据。

关键词：牛支原体（Mycoplasma bovis）；分离；鉴定；遗传进化分析

中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2016）09-0005-02

牛支原体（Mycoplasma bovis）是感染牛的一种重要的致病性病原体，可导致牛肺炎、耳炎、乳腺炎、关节炎、角膜炎、流产或不孕等多种疾病[1，2]。2008年，在中国湖北省首次发现了疑似牛肺疫的呼吸道疾病，发病2 476头（发病率高达50%～100%），死亡610头，随后贵州省和宁夏回族自治区也报道了类似病例[3]。通过检测核酸，发现此呼吸道疾病并非牛肺疫复发，而是一种我国从未出现过的新发支原体传染病[4]。目前，已有内蒙古、广西、天津、重庆、四川、河南等10多个省（市、自治区）报道了类似疫情，牛支原体已经成为威胁我国养牛业的重要病原之一[5]。

在健康牛呼吸道中几乎分离不到牛支原体，只有在感染牛的呼吸道中能够分离到，并经常引起临床发病[6]。本研究对恩施某肉牛场送检的牛肺脏病料进行了病原分离和鉴定，并成功分离获得了该致病菌株。

1 材料与方法

1.1 样品来源

我国湖北恩施地区从北部其他省份引进牛群中，70头引种肉牛出现20%的死亡，从该场收集到送检的病变肺脏样品3份。

1.2 分离用培养基

使用改良后的支原体液体培养基KM2，传代。

1.3 病原分离试验

将待检肺脏组织用含青霉素的双蒸水浸泡后无菌取约5 g组织，研磨后加2 mL液体筛选培养基，1 000 r/min离心5 min取上清，按1∶10倍比稀释接种至液体筛选培养基中，每个稀释度接种1管，共接种5管，置37 ℃培养。每隔48 h进行一次盲传。待盲传至2代后培养基颜色变黄再将其接种于平板固体培养基。将平板置5%CO2培养箱中继续培养72～96 h，进行至少3次克隆纯化后，将培养物保存于-80 ℃。

1.4 特异性PCR鉴定

通过合成的16SrRNA（F1：5′-ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT-3′；R1：5′-CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT-3′）、oppF（F2：5′-CGTTATGCAAGATTAAATACTTACGAC-3'；R2：5′-TGAAAA

CTTTCTCAGCATTAGCC-3′）等引物对分离菌株进行序列测定。应用DNAstar、DNAman、MEGA5.0等生物学软件进行基因序列拼接、比对与分析。

2 结果与分析

2.1 病原分离

在液体培养基中盲传2代后，3份样品培养基颜色开始变黄，72 h后呈现明显的黄色（图1）。

2.2 PCR鉴定与遗传进化分析

16S rRNA测序结果表明，所分离得到的菌株为牛支原体。oppF基因的序列分析表明，M. bovis HB2015与其他菌株oppF基因相似性在99%左右，进一步从基因水平上证实了分离株为牛支原体。同时与GeneBank中收录的其他地方分离株比对，结果显示M. bovis HB2015与M. bovis NM2012内蒙株（GeneBank登录号：CP011348.1）亲缘关系较近，位于同一分支上；而M. bovis CQ-W70（GeneBank登录号：CP005933.1）、M. bovis Hubei-1（GeneBank登录号：CP002513.1）和 M. bovis HB0801（GeneBank登录号：CP002058.1）亲缘关系较近，位于同一分支（图2）。

2.3 牛支原体HB2015的冻干

在菌株冻干保存时，比较了明胶-蔗糖保护剂（1.5%明胶+12.5%蔗糖）、牛奶-蔗糖保护剂（10%牛奶 +5%蔗糖）的冻干效果，结果显示明胶-蔗糖保护剂冻干效果较好，复苏成功率高于牛奶-蔗糖保护剂。因此，选用明胶-蔗糖保护剂对牛支原体进行了大量的冻干，并将分离获得的M. bovis HB2015菌株送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC M 2016559。

3 讨论

牛支原体自1961年由Hale在美国从乳房炎病牛牛乳中分离出至今已有半个世纪[7]。感染牛可成为新的感染源经呼吸道传播，其传播过程可持续几个月或长达几年之久[8]。自2008年开始，中国部分地区从外地引进肉用牛暴发了由牛支原体引起的以坏死性肺炎为主要特征的传染性牛支原体肺炎疫情[3，4]。

病原的分离鉴定是诊断动物疫病的金标准，但由于牛支原体的培养条件很高，分离培养较为困难，从临床病料中分离、培养、鉴定的方法很少用于牛支原体的诊断。本试验采用牛支原体专用液体培养基KM2从3份肺脏病料样品中分离到M. bovis HB2015分离菌株。牛支原体和无乳支原体基因组序列同源性较高[9]，有文献报道在用牛支原体16SrRNA引物扩增无乳支原体时，也可以出现目的条带[10，11]。根据rifutbegovic等[12]的报道，牛支原体和无乳支原体的寡肽膜透酶（oppF）的基因差异较大，PCR扩增时可以从牛支原体基因组中扩增出约1.9 kb的片段，而无乳支原体则不能扩增出任何片段，因此针对oppF基因设计的引物可以用于PCR鉴别牛支原体和无乳支原体。

我们对牛支原体分离株的oppF基因进行了克隆与序列的测定，并构建了进化树分析，结果显示M. bovis HB2015与M. bovis NM2012内蒙株（GeneBank登录号：CP011348.1）亲缘关系较近。有意思的是，提供牛支原体HB2015分离用病料的牛场恰恰是从陕西引种，运输回的肉牛到达恩施后发病，而M. bovis HB2015与M. bovis NM2012内蒙株亲缘关系较近，提示牛支原体可能是从陕西引种时就已呈隐性感染，引种回恩施后发病。

本研究从恩施暴发牛支原体的肉牛场中成功分离出牛支原体M. bovis HB2015菌株，并对其进行了遗传进化分析和保藏，HB2015菌株的获得为深入开展牛支原体的诊断试剂和防治剂研究提供了材料基础。

参考文献：

[1] MORTON J， MALMO J， HOUSE J， et al. Mycoplasma bovis in Australian dairy herds[J]. Aust Vet J. 2014，92（9）：322-323

[2] 张 瑞，崔 朋，巴晓亮，等.牛支原体临床分离株牛体毒力和免疫原性比较[J].动物医学进展，2013，34（6）：126-132.

[3] 石 磊，龚 瑞，尹争艳，等. 肉牛传染性牛支原体肺炎流行的初步诊断[J]. 华中农业大学学报，2008，27（4）：572-572.

[4] 辛九庆，李 媛，郭 丹，等. 国内首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到牛支原体[J]. 中国预防兽医学报，2008，30（9）：661-664.

[5] 伍晓红，储岳峰，张 轩，等.牛支原体的分离鉴定及16S rRNA基因序列分析[J].动物医学进展，2012，33（12）：35-37.

[6] GOURLAY R N， THOMAS L H， WYLD S G. Increased severity of calf pneumonia associated with the appearance of Mycoplasma bovis in a rearing herd [J]. Veterinary Record， 1989， 124： 420-422.

[7] HALE H H， HELMBOLDT C F， PLASTRIDGE W N， et al. Bovine mastitis caused by Mycoplasma species[J]. Cornell Veterinarian， 1962， 52： 582-591.

[8] PFUTZNER H. Epizootiology of the Mycoplasma bovis infection of cattle[J]. Zentralblatt fur Bakteriologie Supplement， 1990， 20： 394-399.

[9] 杨铭伟，李 迪，赵海龙，等. 致犊牛肺炎牛支原体南疆株的分离鉴定及oppF基因序列分析[J].中国畜牧兽医，2014，41（12）：25-29.

[10] AYLING R D， NICHOLAS R A J， JOHANSSON K F. Application of the polymerase chain reaction for the routine identification of Mycoplasma bovis [J]. Veterinary Record， 1997， 141： 307-308.

[11] HOTZEL H， SACHSE K， PFUTZNER H， Rapid detection of Mycoplasma bovis in milk samples and nasal swabs using the polymerase chain reaction[J]. Journal of Applied Bacteriology， 1996， 80：505-510.

[12] RIFATBEGOVIC M， ASSUNCAO P， POVEDA J B， et al. Isolation of Mycoplasma bovis from the respiratory tract of cattle in Bosnia and Herzegovina [J]. Veterinary Record， 2007， 160：484-485.