芹菜素与老年大鼠缺血心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的相关性

2017-02-13汪晓洲

中国老年学杂志 2017年1期

关键词：芹菜低剂量心肌细胞

朵杰汪晓洲

(青海省心脑血管病专科医院高血压科,青海西宁 810000)

芹菜素与老年大鼠缺血心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的相关性

朵杰汪晓洲

(青海省心脑血管病专科医院高血压科,青海西宁 810000)

目的对芹菜素与老年大鼠缺血心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax、半胱天冬酶(Caspase)-3表达相关性进行研究。方法选取选择健康的老年大鼠60只，随机分为正常组、假手术组、心肌缺血再灌注组和不同剂量芹菜素组各10只。制作缺血再灌注模型采用结扎左冠状勤脉前降支,心肌缺血30 min,再灌注2 h。假手术组只穿线不结扎，余各组在缺血前10 min股静脉分别注射生理盐水、聚乙二醇、低剂量、中剂量、高剂量芹菜素，检测缺血心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表达。结果正常组和假手术组的凋亡细胞数极少；心肌缺血再灌注组的凋亡细胞数量明显的增多，芹菜素低剂量(1 mg/kg)组：Apil1、芹菜素中剂量(2 mg/kg)组：Apil2、芹菜素高剂量(4 mg/kg)组：Apil4的凋亡的凋亡细胞数下降，其中芹菜素高剂量(4 mg/kg)组：Apil4的凋亡细胞数下降明显。心肌缺血再灌注组的Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR与正常组、假手术组、芹菜素高、中、低剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。芹菜素低剂量组Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR与正常组、假手术组、心肌缺血再灌注组、芹菜素高剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。芹菜素中剂量组Bcl-2、Bax、Caspase-3、AR与正常组、假手术组、心肌缺血再灌注组、芹菜素高剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。且芹菜素低剂量组的Bax、AR与芹菜素中剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。结论芹菜素与缺血心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax、Caspase-3表达存在相关性，且芹菜素可以减轻心肌损伤。

芹菜素；缺血心肌细胞；Bcl-2；Bax；Caspase-3

芹菜素是一种存在于植物中的黄酮类化合物，具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等作用〔1〕。芹菜素可以抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移，诱导肿瘤细胞的凋亡等〔2，3〕。细胞凋亡与心血管疾病之间存在着较大的联系，以往研究认为心肌缺血、再灌注损伤时造成心肌细胞死亡的形式为坏死，氧化应激、负荷过重等不仅会造成心肌细胞的坏死，还可以诱导心肌细胞的凋亡〔4，5〕。芹菜素对心肌缺血、再灌注损伤有保护作用。本文对芹菜素和老年大鼠缺血心肌细胞凋亡及Bcl-2、Bax、半胱天冬酶(Caspase)-3表达相关性进行研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料健康老年大鼠60只，体重200～250 g，将其随机分为6组，正常组、假手术组、心肌缺血再灌注组、芹菜素低剂量(1 mg/kg)组、芹菜素中剂量(2 mg/kg)组、芹菜素高剂量(4 mg/kg)组。

1.2 实验材料和仪器芹菜素(纯度≥98%、陕西慧科植物开发有限公司生产，批号：AP20090727)；细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche公司生产)；Bcl-2、Bax、Caspase-3多克隆抗体、SP试剂盒(博奥森林生物技术有限公司生产)；10%甲醛溶液(自制)；生物信号采集分析系统(澳大利亚埃德仪器国际贸易有限公司生产)；精密天平(型号：Sartorious BS124S)，动物人工呼吸机(成都泰盟科技有限公司生产，型号：HX-300)；电热恒温干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；石蜡切片机(生产企业：浙江金华益迪医疗设备厂)。

1.3 实验方法大鼠采用乌拉坦麻醉，记录Ⅱ导联心电图，颈部正中切口，气管插管，连接呼吸机。在胸部左侧开胸，人工呼吸频率60次/min，通气量20 ml/kg，轻压胸廓，挤出心脏，左冠状动脉起始下方采用医用无损伤缝合针进针，1号丝线穿过冠状动脉前降支下。心脏复位，稳定10 min后，股动脉给药。正常组推注体积容积聚乙二醇(PEG)400和10%无水乙醇，假手术组穿线后10 min股动脉推注等体积生理盐水4 ml/kg，心肌缺血再灌注组缺血前10 min股动脉推注4 ml/kg生理盐水，芹菜素各剂量组缺血前10 min股动脉推注1、2、4 mg/kg芹菜素。正常、假手术组缝合线空置，其他组10 min之后拉紧缝合线，实施压迫结扎左冠状动脉前降支45 min后，结扎线放松，进行2 h的观察，并实施肢体Ⅱ导联心电图、颈动脉血压观察。老年大鼠在实验中，结扎成功的标准为：左心室前壁发绀、同步心电图Ⅱ导联ST段增高。再灌注成功的标准为：左心室前壁由发绀逐渐红润、ST段降低1/2。细胞凋亡标记及半定量分析：针对老年大鼠组织中石蜡包埋的心肌组织，使用末端脱氧核苷酸转移酶介导带荧光dUTP缺口末端标记法进行检测，根据测定的细胞凋亡阳性分布情况，记录每个视野中30个心肌细胞中阳性细胞数，针对平均阳性细胞所占的百分比进行计算，并将其作为细胞凋亡率(AR)。

1.4 Bcl-2、Bax、Caspase-3表达测定选择上述石蜡标本的相应部位，连续切片5张，采用氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)法进行免疫组化染色、二氨基联苯胺(DAB)显色法检验，在每一张切片的阳性表达区域，选择10个无重叠视野，使用图像分析仪器进行分析，记录光密度值均值。心肌组织切片HE染色之后，对其心肌组织的病理性损伤改变进行观察分析。

1.5 统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 心肌细胞凋亡分析心肌组织细胞凋亡细胞呈现棕色，正常的细胞核染蓝色。正常组和假手术组凋亡细胞数极少；心肌缺血再灌注组凋亡细胞数量明显增多。见图1。

2.2 Bcl-2、Bax、Caspase-3表达分析心肌缺血再灌注组的AR值显著高于其他组(P<0.05)。芹菜素低剂量组AR显著高于正常组、假手术组、芹菜素中、高剂量组(P<0.05)。芹菜素中剂量组AR显著高于正常组、假手术组、芹菜素高剂量组(P<0.05)。心肌缺血再灌注组Bcl-2显著高于正常组和假手术组(P<0.05)，显著低于芹菜素各剂量组(P<0.05)。芹菜素不同剂量组Bcl-2两两差异显著(P<0.05)，芹菜素高剂量组Bcl-2显著高于其他组(P<0.05)。心肌缺血/再灌注组Caspase-3显著高于正常组、假手术组、芹菜素低剂量(P<0.05)。芹菜素各剂量组Caspase-3均显著高于正常组和假手术组(P<0.05)，芹菜素不同剂量组Caspase-3两两差异显著(P<0.05)，芹菜素中剂量组Caspase-3显著高于其他组(P<0.05)。心肌缺血再灌注组的Bax显著高于其他组(P<0.05)。不同剂量芹菜素组Bax两两差异显著(P<0.05)，芹菜素低剂量组Bax显著高于正常组、假手术组、芹菜素高、中剂量组(P<0.05)。正常组和假手术组Bax显著低于其他组(P<0.05)。见表1。

图1 各组心肌缺血再灌注细胞凋亡影响(TUNEL,×400)

组别Bcl-2(OD)Bax(OD)Caspase-3(OD)AR(%)正常组0.11±0.013)0.07±0.013)0.05±0.013)0.02±0.013)假手术组0.12±0.023)0.08±0.013)0.06±0.013)1.22±0.121)3)心肌缺血再灌注组0.23±0.041)2)1.06±0.131)2)0.18±0.021)2)29.78±1.351)2)芹菜素低剂量组0.31±0.031)2)3)0.55±0.111)2)3)0.10±0.011)2)3)22.16±1.141)2)3)芹菜素中剂量组0.34±0.041)2)3)0.32±0.061)2)3)4)0.93±0.021)2)3)15.46±0.571)2)3)4)芹菜素高剂量组0.41±0.051)2)3)4)5)0.12±0.021)2)3)4)5)0.61±0.021)2)3)4)5)6.57±0.551)2)3)4)5)

与正常组比较:1)P<0.05；与假手术组比较:2)P<0.05；与心肌缺血再灌注组比较:3)P<0.05；与芹菜素低剂量组比较:4)P<0.05；与芹菜素中剂量组比较:5)P<0.05

2.3 心肌组织病理学分析正常组和假手术组心肌纤维着色不均匀，且排列紊乱心肌细胞呈现大片状的死亡，界限不清，细胞核有破裂、溶解、消失现象。芹菜素低剂量和中剂量组心肌纤维着色不均，排列紊乱，且心肌细胞中水肿，空泡样改变，细胞核有浓缩、溶解、消失现象，有少量炎性细胞浸润。芹菜素高剂量组心肌肌纤维相对完整，排列较为整齐，着色均匀。细胞核有浓缩、溶解现象。芹菜素剂量可以依赖性地减轻心肌细胞损伤的病理学形态变化。见图2。

图2 各组心肌组织病理形态学变化(HE，×400)

3 讨论

芹菜素在各种疾病的治疗中，尤其是肿瘤疾病、心血管疾病的治疗中，有良好的作用〔6〕。芹菜素自身有多种药理作用，在心肌细胞凋亡、抗肿瘤、抗炎等方面有显著的效果〔7〕。芹菜素是一种在水果、蔬菜中广泛存在的一种黄酮类化合物，相关实验研究证明，芹菜素在抑制肿瘤细胞的生长、诱导凋亡中起着重要的作用〔8〕。

芹菜素可以扩张血管，对血脂、血压进行调节，保护血管内皮细胞等，将芹菜素用于老年心血管疾病等治疗中，有显著的治疗效果〔9，10〕。芹菜素是一种天然的抗氧化剂，其在抗病毒、抗炎、抗肿瘤等方面有显著的作用，芹菜素可以改善血管内皮细胞的收缩功能，具有抗心律失常、心肌梗死等作用，可以缩小心肌缺血/再灌注损伤面积，对心肌缺血/再灌注损伤起到有效的保护作用〔11，12〕。

细胞的凋亡受到细胞内凋亡调节蛋白的调控，Bcl-2、Bax是两种凋亡调节蛋白，在细胞的凋亡中起着关键性的作用，Bcl-2、Bax的高低，与细胞凋亡存在直接的关系，Bax升高则会加速细胞的凋亡，Bcl-2的升高，则会抑制细胞的凋亡，所以细胞受到凋亡刺激之后，其生存率受到Bcl-2、Bax的影响。Caspase-3是下游阶段中关键的凋亡蛋白酶，Caspase-3蛋白酶的激活，会抑制细胞的凋亡。

1 任环宇,唐修文.芹菜素对肺癌细胞的抗增殖作用和抗肿瘤药物的增敏作用〔J〕.浙江大学学报(医学版),2011;40(5):508-14.

2 潘伦,徐溢.芹菜素抗肿瘤作用的研究状态〔J〕.中国医药指南,2009;7(12):57-8,96.

3 张慧芝,白建平,于肯明,等.芹菜素预处理对缺血再灌注大鼠心肌肿瘤坏死因子-α表达的影响〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2011;9(7):834-5.

4 高瑞林,李毅宁,张建育,等.芹菜素对膀胱癌T24细胞增殖、凋亡和CyclinD1、 Caspase-3表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2014;34(16):4569-71,4572.

5 吴华涛,马涛,孟勇,等.芹菜素对肿瘤抑制作用研究进展〔J〕.中国现代医生,2009;47(6):41-2,44.

6 潘雪刁,杨周萍,周四桂,等.芹菜素对人肺癌 A549细胞凋亡及相关蛋白 Bax、Bcl-2表达的影响〔J〕.中国医药生物技术,2013;33(4):259-63.

7 陈宁,叶丽红.芹菜素抑制肿瘤细胞增殖机制研究进展〔J〕.环球中医药,2014;7(2):151-4.

8 刘博文,张斌,陈祖锦,等.芹菜素抗肿瘤机制研究进展〔J〕.国际肿瘤学杂志,2010;37(11):824-7.

9 李占飞.芹菜素抗肿瘤作用及其机制研究进展〔J〕.疾病监测与控制,2013;7(10):616-8.

10 杨红霞,孙倩.芹菜素的现代研究进展〔J〕.长治医学院学报,2012;26(5):397-400.

11 张强,赵新淮,张涛,等.黄酮醇化合物中B环结构与其诱导癌细胞凋亡的关系〔J〕.中国老年学杂志,2012;32(9):1865-7.

12 史婷婷,白建平,梁月琴,等.芹菜素对大鼠缺血/再灌注心肌细胞凋亡及相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响〔J〕.中国药理学通报,2011;27(5):666-71.