IL-7R在膝关节骨关节炎滑膜中的表达及意义

赵清，王婧，王来芳

（河南大学淮河医院，风湿免疫科，河南开封475000）

临床论著

IL-7R在膝关节骨关节炎滑膜中的表达及意义

赵清，王婧，王来芳

（河南大学淮河医院，风湿免疫科，河南开封475000）

目的探讨白细胞介素7受体（IL-7R）基因在膝关节骨关节炎（KOA）疾病中的表达作用及意义，为其诊断和治疗以及进一步研究提供一定的科学依据。方法选取河南大学淮河医院骨科70例患者新鲜滑膜组织，采用Trizol法提取总RNA，采取Applied Biosystems逆转录试剂盒逆转录合成cDNA第一链，用实时逆转录聚合酶链反应（real time RT-PCR）检测膝关节髌上囊滑膜组织中IL-7R基因的表达。结果IL-7R基因表达在KOA滑膜组织中降低（P＜0.05）。结论IL-7R在KOA滑膜中的表达下降，且与膝关节骨关节炎病变有密切的关联，为检测和治疗KOA疾病提供一定数据支撑和参考。

骨关节炎；白细胞介素7受体；基因；滑膜组织

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种渐进性丧失功能的骨科常见退行性疾病[1]。它是一种严重危害中老年人健康的慢性骨关节疾病，表现为关节疼痛、关节僵硬、失去活动灵活性或致残[2]。在临床上最为常见的是膝关节骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA），且其发病率很高，是一组有着不同病因却有着相似的生物学、形态学和临床表现的疾病[3]。目前，对于KOA的治疗方法主要是早期采用药物治疗来保护患者和延缓病变，或利用玻璃酸钠联合复方倍他米松注射于关节腔内，对KOA有显著疗效且无明显的不良反应[4]。而对于严重的晚期患者，就要采用手术治疗方法，研究表明，KOA发生、发展的过程与多种细胞因子和生长因子有关，如白细胞介素1家族、转移生长因子和炎症因子等[5]。其中炎症因子大部分为炎性滑膜组织分泌，白细胞介素7受体（interleukin-7 receptor，IL-7R）就是该过程中最重要的炎症因子之一。在淋巴细胞增殖和分化过程中IL-7R是必不可缺少的因子，而导致B系淋巴细胞和T系淋巴细胞生成的障碍主要是其在细胞表面的缺失[6]，造成重症联合免疫缺陷病主要是IL-7Rα或c缺陷引起的T细胞缺乏。最新研究表明，阻断IL-7R可以治疗类风湿性关节炎[7-8]。本实验旨在运用实时逆转录集合酶链反应（real time RT-PCR）方法检测IL-7R基因在KOA滑膜中的表达情况。

1 资料与方法

1.1 一般资料

OA组：取膝关节骨关节炎行膝关节人工关节置换术患者40例，平均年龄为（65.66±1.34）岁的膝关节髌上囊滑膜组织。对照组：取在关节镜下交叉韧带损伤和半月板损伤患者30例，平均年龄为（21.78± 2.58）岁的膝关节髌上囊滑膜组织。

取下的膝关节髌上囊滑膜组织离体后，直接置于含有液氮的无菌管中，30 min后放入-80℃的冰箱中保存备用。

1.2 诊断标准

KOA患者均符合放射线Kellgren-Lawrence分级诊断标准的Ⅲ、Ⅳ级（见表1）。

1.3 实验试剂

Trizol Reagent（Invitrogen公司），M-MLV Reverse Transcriptase（Invitrogen公司），SuperscriptⅢRT（Invitrogen公司），RNase out（Invitrogen公司），Primers：9N Random Primer及PCR Primers（Invitrogen公司），5×First-Strand Buffer（Pro Mab公司），2×Loading Buffer（Pro Mab公司），Recombinant Rnasin R RNase Inhibitor（Promega公司），dNTP Mixture（TaKaRa公司），2 000 bp DNA maker（TaKaRa公司），Ex Taq酶（Fermentas公司），0.1 mol DTT（碧云天生物技术研究所），Power SYBR R Green PCR Master Mix（Applied Biosystems公司）。

表1 Kellgren-Lawrence分级诊断标准

1.4 实验仪器

Real time RT-PCR仪7500型（Applied Biosystems公司），电泳仪及电源、附件（BIO-RAD公司），全自动菌落及化学发光凝胶成像系统（UVP公司），低温度高速离心机（SIGMA公司），超低温冰箱（-80℃）（Forma Scientific公司），低温冰箱（-20℃）（海尔电器有限公司），各种无酶吸头（Axygen公司），各种无酶EP管（Axygen公司），Tube管（Axygen公司），研磨器（Roche公司）。

1.5 实验方法

1.5.1 RNA的提取（Trizol法）取约100 mg新鲜冷冻膝关节髌上囊滑膜组织，将其研成粉末，充分挥发液氮，加入1 ml Trizol Reagent，混匀，室温下静置10 min。再加入200 μl氯仿，剧烈震荡混匀，静置8 min，分层。在4℃的条件下离心15min（15000r/min）。吸取上层水液400 ml，移至1.5 ml Tube管中。再加入等体积异丙醇溶液，混匀，室温下静置8 min。再在4℃的条件下离心15 min（15 000 r/min）。弃去上清液，加入经DEPC处理的75％冷乙醇，斡旋震荡，使沉淀漂浮，4℃离心5 min（15 000 r/min），再弃去上清液，干燥。在20μl的Tube管中用ddH2O溶解RNA。取2μl RNA，用ddH2O稀释100倍，即得。

1.5.2 cDNA第一链的合成取2μg RNA置于反应管中，加入Oligo dT 1μl，再加入2.5 mmol dNTP mix 4μl，混匀，加ddH2O至13μl。在60℃条件下静置10 min后，放在冰上放置1min以上。再在反应管中加入5×First-Strand Buffer 4μl，0.1 mmol DDT 1μl，RNase out（40 u/μl）1μl，SuperscriptⅢRT 1μl，震荡混匀后离心，在70℃条件下通过灭活逆转录酶，合成cDNA第一链，在4℃条件下保存。

1.5.3 RNA逆转录逆转录反应体系和反应程序见表2。逆转录终止反应程序：在70℃条件下加入1.5 mol NaOH 5μl终止逆转录反应，10 min后，加入10mol/L乙酸1μl中和，再加入Nuclease-Free Water至50μl，在4℃可以短期低温保存，置入-80℃冰箱长期低温保存。

1.5.4 逆转录终止反应程序在70℃条件下加入1.5 mol氢氧化钠5μl终止逆转录反应，10 min后，加入10 mol/L乙酸1μl中和，再加入Nuclease-Free Water至50μl，在4℃可以短期低温保存，置入-80℃冰箱长期低温保存。

实时定量PCR反应体系见表3。实时定量PCR程序见表4。

1.5.5 实时定量PCR产物1.5％非变性琼脂糖凝胶电泳检测见表5。1.5％非变性琼脂糖凝胶电泳检测条件：120 V，15～20 min。1.5％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测条件：120～130 V，15～20 min。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，本实验按照随机、对照、均衡及重复的分组设计原则，对其行多组间t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表2 实时定量RT-PCR逆转录反应体系及反应程序

表3 实时定量PCR反应体系

表4 实时定量PCR反应程序

表5 实时定量PCR产物1.5％非变性琼脂糖凝胶电泳检测

2 结果

2.1 组织总RNA电泳鉴定

1.5 ％甲醛变性琼脂糖凝胶电泳结果中可以看出，real time RT-PCR反应的特异性都非常好。见图1。

2.2 Real time RT-PCR分析

实验结果表明，KOA患者膝关节髌上囊滑膜组织较正常滑膜组织中IL-7R基因表达降低。见图2。

2.3 IL-7R mRNA统计学分析

IL-7R mRNA统计学分析见表6。

统计结果表明，膝关节骨关节炎滑膜组织中IL-7R的表达量低于正常膝关节滑膜组织的表达。

图1 电泳结果

图2 骨关节炎膝关节滑膜组织与正常滑膜组织对IL-7R mRNA的表达

表6 人膝关节骨关节炎滑膜组织与正常滑膜组织对IL-7R mRNA的相对表达量（±s）

项目P值2-△△Ct0.15±0.640.90±0.120.001骨关节炎滑膜组织正常滑膜组织

3 讨论

目前，国内对于运用白细胞介素7受体诊断和治疗膝关节骨关节炎的研究并不多，故本文研究IL-7R基因与KOA患者的关系。通过RT-PCR的方法对KOA患者和正常的膝关节滑膜组织进行比较，结果发现IL-7R基因在膝关节骨关节炎滑膜组织中的表达明显降低。

骨关节炎是一种与年龄有密切关系的骨科普遍疾病，随着世界老龄化人口的增多，膝关节骨关节炎患者的发病率也有逐年增长的趋势，严重地影响老年人的正常生活以及生活质量。骨关节炎最终病理变化的主要特征是关节软骨的变性和破坏，主要是由于软骨合成与降解平衡的失调所造成的[9-10]。而骨关节炎的主要特征是软骨下骨的硬化和骨赘的形成[11]。在该过程中是滑膜炎症的影响和参与导致软骨的结构变化。现今治疗膝关节骨关节炎还未有比较合适的方法，而目前的基因治疗骨关节炎正在逐渐成为研究的热点[12]。近几年研究表明，细胞因子与KOA的形成及发展有着十分密切的关系，其中的白细胞介素与白细胞介素受体就起着至关重要的作用[13]。

白细胞介素7受体是由一条特异性配体结合α链（IL-7Rα）与一条公用链（c）结合而成的[14]。研究表明，类风湿性关节炎患者滑膜组织中的IL-7R α，比KOA患者表达更高，其表达且与白细胞介素7的表达有着密不可分的关系[15-16]。白细胞介素7受体信号途径可以影响软骨细胞，软骨细胞分泌白细胞介素7，且也可以表达白细胞介素7受体，并能够接受白细胞介素7传播的刺激信号，且可以分泌能够降解软骨中蛋白聚糖的基质金属蛋白酶13和蛋白多糖，故可以通过阻断白细胞介素7受体的方法，来防止软骨的降解及骨质的损坏[17]。

本研究结果表明，膝关节骨关节炎滑膜组织比正常的滑膜组织有明显的基因表达差异。在KOA患者的膝关节滑膜中形成的IL-7R在KOA的病理过程中起到重要的作用，而其也有可能是造成膝关节滑膜炎症持续化及慢性化的主要原因。在今后的诊断和治疗中可以把IL-7R作为一个靶点，为临床上治疗膝关节骨关节炎提供一个新的方法。

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（张西倩 编辑）

Expression and significance ofIL-7Rgene in synovium of osteoarthritic knee

Qing Zhao,Jing Wang,Lai-fang Wang
(Department of Immunology,Huaihe Hospital of Henan University,Kaifeng, Henan 475000,China)

ObjectiveTo discuss expression of knee joint synovialIL-7Rgenes in knee osteoarthritis(KOA)and the significance so as to provide scientific basis for diagnosis,treatment and research of knee osteoarthritis.MethodsFresh synovial tissue was collected from 70 orthopedic patients in a hospital.Trizol method was used to extract total RNA in the synovial tissue.The Applied Biosystems retrovirus kit was used to synthesize the first chain of cDNA through reverse transcription.The expression ofIL-7Rgene in osteoarthritic knee synovium was detected by RT-PCR.ResultsIL-7Rgene expression in osteoarthritic knee synovial tissue obviously decreased(P＜0.01).ConclusionsIL-7Rexpression in the osteoarthritic knee synovial tissue obviously decreases and is positively correlated with the progression of KOA.Therefore,it provides available information for the detection and treatment of KOA.

osteoarthritis;IL-7R;gene;synovial tissue

R684.3

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.009

1005-8982（2017）02-0052-04

2016-07-09