MicroRNA-300在胆管癌患者血清中的表达及其临床意义*

郭婧澜，谭蓓蓓，叶婷

（西南医科大学附属医院1.检验科，2.核医学科，四川泸州646000）

临床论著

MicroRNA-300在胆管癌患者血清中的表达及其临床意义*

郭婧澜1，谭蓓蓓2，叶婷1

（西南医科大学附属医院1.检验科，2.核医学科，四川泸州646000）

目的探讨microRNA-300（miR-300）在胆管癌患者及健康对照血清中的表达及其在诊断和判断预后方面的临床价值。方法选取107例胆管癌患者和107例健康对照的血清标本，提取血清总RNA，通过实时定量PCR检测血清miR-300的表达水平，并绘制ROC曲线检测miR-300在胆管癌中的诊断价值；采用χ2检验、Kaplan-Meier法分析miR-300的表达水平与胆管癌患者临床特征及患者5年总体生存率之间的关系。结果胆管癌患者血清中miR-300的表达水平高于健康对照者（P＜0.05），且在术后降低；miR-300为胆管癌有效的诊断指标；血清miR-300的表达与胆管癌患者的临床分期密切相关（P=0.010），而与年龄、性别及分化程度无相关；血清miR-300高表达的胆管癌患者5年总体生存率低于血清miR-300低表达患者。结论胆管癌患者血清中miR-300表达增高，是胆管癌临床诊断和判断预后的有效分子指标，具有重要的临床应用价值。

miR-300；诊断；预后；胆管癌

胆管细胞癌是起源于肝内或肝外胆管的一组异质性的并以胆管分化为主要病理特征的癌症[1-2]。胆管细胞癌发病率在肝胆系统肿瘤中高居第2位，且在近几十年来呈逐年上升趋势[3]。胆管癌对放、化疗等传统治疗手段敏感性极低，且早期易发生淋巴转移或转移，5年生存率仅5％～10％[4-5]。目前根治性切除术是胆管癌的首要治疗方法，但由于缺少有效的早期诊断方法，大部分患者初次就诊时肿瘤已发生转移而失去手术机会。因此，寻找胆管癌早期诊断和判断预后的分子对提高胆管癌患者的术后生存期及生存质量有着至关重要的作用。

MicroRNA（miRNA）是一类长度为18～25个核苷酸大小，进化上相对保守的非编码小分子RNA，主要通过与靶基因的3’-UTR区域结合抑制靶基因表达，进而调控其下游信号通路而参与多种生理进程[6-8]。研究表明[9-10]，miRNA在胆管癌的发生发展中同样发挥着重要的作用，多种miRNA可通过影响胆管癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和转移能力而调控胆管癌的进展。此外，新的研究结果显示[11-14]多种miRNA在胆管癌患者血清或胆汁中可稳定表达，并可作为胆管癌患者早期诊断指标。本研究将检测胆管癌患者血清中miR-300的表达并利用统计学方法分析miR-300在胆管癌中的诊断及判断预后的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 研究对象选取2007年7月-2010年12月于西南医科大学附属医院就诊的胆管癌患者107例以及同期健康对照者107例。所有入选者的临床资料完整。病例纳入标准如下：胆管癌患者均经术后病理组织学确诊为胆管癌，且均为初诊初治患者；入组患者术前均未接受任何放、化疗和生物治疗；入组患者肝肾功能未见显著异常；未合并其他肿瘤或严重心脑血管疾病。入组患者术前、术后空腹各采血5ml，真空干燥管中保存，1 500 r/min离心10 min，置入-80℃冰箱冷冻保存待测。本研究经西南医科大学附属医院医院伦理委员会批准，所有入选者均同意使用其血清标本用于科学研究并签署知情同意书。

1.1.2 实验试剂和仪器MicroRNA-300（miR-300）和内参U6引物购自上海吉玛科技有限公司，Trizol细胞裂解液购自美国Initrogen公司，miRcute miRNA提取分离试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，miRNA逆转录引物及逆转录试剂盒购自日本TaKaRa公司，SYBR Premix试剂盒购自日本TaKaRa公司，糖类抗原19-9定量测定试剂盒（电化学发光法）购自瑞士罗氏公司。主要仪器如下：美国罗氏Cobas e 601电化学发光分析仪，美国ABI公司7500实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）仪，美国Thermo公司-80℃冰箱，美国Eppendorf公司台式低温高速离心机。

1.2 方法

1.2.1 miR-300的提取及逆转录参照miRcute miRNA提取分离试剂盒所述步骤提取血清miR-300。具体步骤如下：200μl血清中加入等体积裂解液，12 000 r/min离心10 min后加入氯仿。震荡后12 000 r/min离心30 s，取水相层转移至新的EP管中。加入转移液体积1/3的无水乙醇，转入吸附柱，12 000 r/min离心30 s。重复过柱离心后，加入500μl去蛋白液，12 000 r/min离心30 s。而后加入漂洗液，12 000 r/min离心2 min。向吸附柱中加入30μl去离子水，室温放置2 min，12 000 r/min离心2 min，所得即为提取的miRNA。紫外分光仪检测RNA浓度及纯度。应用特异性miRNA逆转录引物，并将miRNA逆转录合成cDNA，每个逆转录体系中含有10 ng的RNA模板。逆转录的条件：15℃20 min，42℃30min，85℃5min。

1.2.2 qRT-PCR反应条件为95℃10 s，95℃20 s，62℃40 s，共设40个循环。采用的相对定量法计算miR-300的相对表达量（F），F=2-Δct，Δct=ctmiR-300-ctU6，其中ct为每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

1.2.3 血清CA19-9含量检测血清稀释后，使用电化学发光分析仪及配套CA19-9检测试剂盒对胆管癌患者血清CA19-9进行检测，参考值为0～34 u/ml。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，胆管癌患者及健康对照者血清miR-300组间比较用t检验，血清miR-300与胆管癌患者临床特征之间的关系采用χ2检验，绘制受试者工作曲线（ROC），评估血清miR-300及CA19-9在胆管癌患者中的诊断价值，采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验分析胆管癌患者各组间生存差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-300在胆管癌患者和健康对照者血清中的表达水平

通过qRT-PCR检测胆管癌患者和健康对照者血清中miR-300的表达，结果显示，胆管癌患者血清中miR-300的表达量为（4.071±1.625），健康对照血清中miR-300的表达量为（2.171±1.055）。胆管癌患者血清中miR-300的表达水平高于健康对照组，差异有统计学意义（t=3.237，P=0.014），见图1。

图1 胆管癌患者及健康对照血清中miR-300的表达量

2.2 miR-300在胆管癌患者术前及术后血清中的表达

通过qRT-PCR检测胆管癌患者术前和术后血清中miR-300的表达，结果显示，胆管癌患者术前血清中miR-300的表达量为（4.071±1.625），术后血清中miR-300的表达量为（1.689±1.074）。胆管癌患者术后血清miR-300的表达低于术前，差异有统计学意义（t=5.198，P=0.021），见图2。

2.3 miR-300在胆管癌中的诊断价值

根据血清miR-300的表达水平，建立miR-300和胆管癌筛查指标CA19-9的ROC曲线，利用ROC曲线评价两者在胆管癌中的诊断价值。结果显示，miR-300 ROC曲线下面积0.933（95％CI：0.903，0.964），敏感性为87.8％，特异性为84.1％；CA19-9 ROC曲线下面积为0.871（95％CI：0.826，0.917），敏感性为81.3％，特异性为85.9％，见图3。血清miR-300和CA19-9在胆管癌中均具有较高的诊断价值。

2.4 miR-300与胆管癌患者临床相关特征的关系

分析血清miR-300表达与胆管癌患者临床特征（年龄、性别、临床分期、分化程度）的关系。根据血清miR-300的表达水平，将胆管癌患者分为高表达组（n=61）与低表达组（n=46）。结果显示，血清miR-300的表达水平与胆管癌患者的临床分期密切相关，随着胆管癌患者临床分期的进展，血清miR-300的表达亦逐渐升高，两组差异有统计学意义（χ2=7.147，P=0.010）。血清miR-300的表达与胆管癌其他临床特征，包括年龄、性别、分化程度均无相关性，组间比较差异无统计学意义。见附表。

2.5 miR-300与胆管癌患者5年生存率之间的关系

Kplan-Meier生存曲线分析结果显示，血清miR-300高表达组术后5年总体生存率低于血清miR-300低表达组，两组间差异有统计学意义（Log-rank test：P=0.022）。见图4。

图2 胆管癌患者术前及术后血清中miR-300的表达

图3 血清miR-300及CA19-9诊断胆管癌的ROC曲线

图4 血清miR-300与胆管癌患者术后5年总体生存率之间的关系

附表血清miR-300表达与胆管癌患者临床相关资料的关系例

3 讨论

近年来，研究发现miRNA可稳定存在于血液、尿液和胆汁等生理液体中，更为重要的是血清中游离miRNA被证实为包括胆管癌在内的多种肿瘤的有效诊断指标之一，能够稳定地被检测到并且在一定程度上提示肿瘤的状态，是非常有前景的肿瘤标志物[15-16]。本研究通过检测胆管癌患者和健康对照者血清中miR-300的表达情况，发现与健康对照者比较，miR-300在胆管癌患者血清中表达上调。更为重要的是，在胆管癌患者术后，血清miR-300的表达下调，这说明miR-300为胆管癌特异性的miRNA，血清中miR-300的表达水平可在一定程度上反应胆管癌的进展情况。因此本研究进一步分析血清miR-300在胆管癌中的诊断价值，发现血清miR-300可作为胆管癌有效的诊断指标，具有较高的敏感性和特异性。本研究分析血清miR-300的表达与胆管癌患者临床特征的关系发现，随着胆管癌患者临床分期的进展，血清miR-300的表达亦逐渐升高，但是miR-300的表达与胆管癌其他临床特征，包括年龄、性别、分化程度均无相关性。本研究分析血清miR-300的表达与胆管癌患者术后5年生存率的关系，结果显示，血清miR-300高表达组的术后5年生存率较miR-300低表达组下降。

miR-300是长度为22个核苷酸的非编码RNA分子，与多种肿瘤的发生及进展密切相关。miR-300的功能具有组织和空间特异性，在不同肿瘤中可作为癌基因或抑癌基因而发挥作用。研究发现[17]骨肉瘤组织中miR-300表达上调，可促进骨肉瘤细胞的增殖和转移，并与骨肉瘤患者的不良预后密切相关。另有研究发现[18]，在骨肿瘤中miR-300促进细胞的增殖及侵袭，并通过潜在分子机制为靶向抑制BRD7分子表达。此外，在乳腺癌中miR-300可通过靶向抑制P53的表达促进乳腺癌的增殖。然而，头颈部鳞状细胞癌中，研究发现[19]miR-300可通过调控Twist的表达而抑制EMT和肿瘤的转移。新近研究发现[20]，miR-300可稳定存在于卵巢癌患者血清中，并可作为卵巢癌诊断的分子指标。本研究探讨miR-300在胆管癌患者血清中的表达及其在胆管癌中的诊断和预后方面的临床价值，结果提示，血清miR-300的表达在胆管癌中显著上调，且具有一定的特异性。此外，胆管癌患者术后血清miR-300的表达水平较术前降低，这说明随着胆管癌组织的切除，血清miR-300的表达水平下降，血清miR-300的表达水平可在一定程度上反应胆管癌组织中miR-300的表达水平，但仍需进一步的实验明确血清miR-300在胆管癌早期诊断中的特异性。更为重要的是，血清miR-300的表达与胆管癌患者临床分析呈正相关，并具有较高的诊断和判断预后的临床价值。本研究结果提示miR-300在胆管癌中可能作为癌基因发挥作用。综合既往研究和本研究，进一步明确了miR-300的表达及功能具有组织和空间特异性，需进一步的机制研究明确其在胆管癌中发挥癌基因作用的分子机制。

综上所述，本研究证实胆管癌患者血清中miR-300表达高于健康对照组；胆管癌患者术后miR-300的表达水平下降；血清中miR-300为胆管癌有效的诊断指标；胆管癌患者血清miR-300的表达水平与胆管癌患者的临床分期密切相关；血清中miR-300高表达的胆管癌患者5年生存率低于血清miR-300低表达组。本研究为胆管癌发生及进展的机制研究奠定了一定的前期基础，为胆管癌的早期诊断及预后判断提供了潜在靶点。

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（张蕾 编辑）

Expression of serum miR-300 in cholangiocarcinoma patients and clinical significance*

Jing-lan Guo1,Bei-bei Tan2,Ting Ye1
(1.Clinical Laboratory,2.Department of Nuclear Medicine,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou,Sichuan 646000,China)

ObjectiveTo detect the expression of serum miR-300 in cholangiocarcinoma patients and discuss its clinical significance．MethodsSerum samples of 107 cholangiocarcinoma patients and 107 normal control patients were collected.Quantitative real-time polymerase chain reaction(qRT-PCR)was used to detect the expression of serum miR-300.Diagnostic value of serum miR-300 in cholangiocarcinoma was analyzed by the receiver operating characteristic(ROC)curve.Associations between serum miR-300 expression and clinicopathologic features of cholangiocarcinoma patients were analyzed by χ2test.Association of serum miR-300 expression and 5-years overall survival of cholangiocarcinoma patients were analyzed by Kaplan-Meier methods．ResultsThe expression of serum miR-300 in the cholangiocarcinoma patients was statistically higher than that of the normal controls(P＜0.05), moreover,the expression of serum miR-300 was significantly down-regulated after surgery.The expression of serum miR-300 in the cholangiocarcinoma patients was significantly associated with clinical stage(P=0.010),but had no significant association with age,gender or differentiation status of cholangiocarcinoma.Cholangiocarcinoma patients with high serum miR-300 expression had a significantly lower 5-year overall survival rate compared to those with low serum miR-300 expression.ConclusionsThe expression of serum miR-300 is significantly up-regulated incholangiocarcinoma,and serum miR-300 is a promising diagnostic and prognostic biomarker in cholangiocarcinoma.

:miR-300;diagnosis;prognosis;cholangiocarcinoma

R735.8

：A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.02.007

1005-8982（2017）02-0042-05

2016-07-20

泸州医学院科研课题青年基金（No：2012QN-50）