新型锍类化合物的合成及其DNA复合性能

吴春阳, 吴晨悦, 张 莹, 余丽芸, 李 婧

(黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

·研究论文·

新型锍类化合物的合成及其DNA复合性能

吴春阳, 吴晨悦, 张 莹, 余丽芸, 李 婧*

(黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319)

报道了一类新型的以锍离子提供正电荷的阳离子脂质体的合成。以四氢噻吩和四氢噻喃为原料，在四氟硼酸银体系中与链状碘代脂肪烷烃经取代反应制得硫正离子化合物，产物用氯离子交换树脂交换得阴离子为氯离子的8种新型的链状锍类鎓氯盐脂质体化合物，其结构经1H NMR,13C NMR, FT-IR和HR-MS(ESI)表征。凝胶电泳阻滞实验表明该类锍化合物具有和DNA聚合并形成复合物的能力，随着脂肪链的增长，复合能力增强。

四氢噻吩; 四氢噻喃; 碘代烷; 锍类化合物; 阳离子脂质体; DNA复合物; 合成; DNA复合性能

阳离子脂质体作为非病毒载体被广泛应用于基因疗法的研究中，其易于制备、可自然降解和免疫原性低等优点使其成为最有发展前景的载体[1-4]。已报道的阳离子脂质体多数建立在可质子化的氮原子基础上，包含疏水长链和季铵盐阳离子头部。常用的基团有一级胺、二级胺、三级胺、大环多胺、咪唑及脒等[5-7]，脂质体碳链的长度为C8～C16，随着碳链增长，对DNA的键合能力增强。如溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)是常用的脂质体载体，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)是基因转染的辅助脂质，溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)，能溶解细胞膜，被用作阳离子洗涤剂[8-9]。带有正电荷的锍类化合物在分子设计中日益受到研究人员的关注。文献报道Salacino及其同类物具有治疗II型糖尿病的潜力[10-11]；生物体内的S-腺苷甲硫氨酸以及S-甲基蛋氨酸是生物相关的锍类化合物；锍类化合物用于模拟糖基转移中的羰基碳鎓过渡态[12]。对锍类化合物功能的研究逐渐扩展开来，然而利用其正电性在复合DNA，以及作为基因载体的研究还未有报道。

Scheme 1

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BrukerAscend 600M AVANCEⅢ HD型核磁共振仪(CDCl3为溶剂，TMS为内标)；Thermo Nanodrop 2000C型分光光度计；NICOLET 380型红外光谱仪(KBr压片)；Thermo Finnigan型质谱仪；Univeral Hood II型凝胶成像仪；Power PacTMUniversal Power Supply型电泳仪。

四氢呋喃和1-碘十六烷，Alfa Aesar公司；四氢噻吩，阿拉丁公司；四氟硼酸银，百灵威公司；碘代正丁烷，Macklin公司；1-碘壬烷和1-碘十二烷，TCI公司；二氯甲烷、甲醇和乙腈，分析纯，泉瑞试剂;薄层层析硅胶板(GF254)，青岛裕民源硅胶厂；柱层析硅胶(100～200目)，国药集团；溴化钾窗片(Φ25×4)，天津博天胜达公司；琼脂糖，Biowest Agarose公司；溴化乙锭，TRIS·HCl和Agar， Biotoped 公司；Na2EDTA·12H2O， Sigma公司；胰蛋白胨、酵母粉和NaCl， Oxoid公司；卡那霉素，Biosharp公司；DH-5α， TIANGEN公司；质粒gWiz-GFP， Aldevron公司；EndoFree Plasmid mega kit, Qiagen公司；λ DNA/EcoR I+Hind III Markers 3， Fermentas公司。

1.2 合成

(1) 3和5的合成通法

将四氢噻吩或四氢噻喃5 mmol溶于无水乙腈(3 mL)中，依次加入1 5 mmol和四氟硼酸银0.974 g (5 mmol)，用铝箔包裹避光，置于油浴中升温至65 ℃冷凝回流，反应24 h(TLC监测原料反应完全)。减压蒸除溶剂，加入甲醇5 mL和离子交换大孔树脂(Cl-交换)50 mg，搅拌2 h，过滤，滤液减压蒸除溶剂，残余物经硅胶柱层析[洗脱剂：A=V(甲醇)∶V(二氯甲烷)]纯化得3和5。

S-正丁烷基-四氢噻吩鎓氯盐(3a): A=1 ∶49,黄色粉末，产率52%,Rf= 0.37;1H NMRδ: 3.65(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.40(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.23(t,J=7.6 Hz, 2H, SCH2), 2.43(m, 2H, SCH2CH2), 2.35(m, 2H, SCH2CH2), 1.77(tt,J=7.6 Hz, 7.6 Hz, 2H, CH2), 1.52(tq,J=7.3 Hz, 7.6 Hz, 2H, CH2), 0.99(t,J=7.3 Hz, 3H, CH3);13C NMRδ: 43.24(2C), 42.08, 28.55(2C), 27.27, 21.52, 13.40; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C8H17S{[M-Cl-]+}145.288 6, found 145.288 7。

S-壬烷基-四氢噻吩鎓氯盐(3b): A=1 ∶19,白色粉末,产率96%,Rf=0.32;1H NMRδ: 3.66(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.39(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.20 (t,J=7.7 Hz, 2H, SCH2), 2.41(m, 2H, SCH2CH2), 2.35(m, 2H, SCH2CH2), 1.77(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.47(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.33～1.25(m, 10H, 5CH2), 0.88(t,J=7.0 Hz, 3H, CH3);13C NMR(150 MHz)δ: 43.24(2C), 42.22, 31.83, 29.24, 29.14, 28.97, 28.39, 24.08(2C), 22.63, 22.47, 22.52, 14.09; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C13H27S{[M-Cl-]+}215.421 5, found 215.421 6。

S-十二烷基-四氢噻吩鎓氯盐(3c): A=1 ∶19，白色粉末，产率83%，Rf=0.61;1H NMRδ: 3.66(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.39(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.20(t,J=7.7 Hz, 2H, SCH2), 2.41(m, 2H, SCH2CH2), 2.35(m, 2H, SCH2CH2), 1.77(tt,J= 7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.33～1.25(m, 16H, 8CH2), 0.97(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 0.88(t,J=7.0 Hz, 3H, CH3);13C NMRδ: 43.25(2C), 42.33, 31.93, 29.64(2C), 29.54, 29.37, 29.33, 29.05, 28.54(2C), 28.30, 25.46, 22.71, 14.15; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C16H33S{[M-Cl-]+}257.501 2, found 257.501 0。

S-十六烷基-四氢噻吩鎓氯盐(3d): A=1 ∶13，白色粉末，产率85%，Rf=0.62;1H NMRδ: 3.65(dt,J=6.6 Hz, 13.0 Hz, 2H, SCH2), 3.40(dt,J=5.72 Hz, 12.8 Hz, 2H, SCH2), 3.21(t,J=7.7 Hz, 2H, SCH2), 2.42(m, 2H, SCH2CH2), 2.35(m, 2H, SCH2CH2), 1.77(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.47(tt,J=7.7 Hz, 7.7 Hz, 2H, CH2), 1.33～1.26(m, 24H, 12CH2), 0.88(t,J=7.0 Hz, 3H, CH3);13C NMRδ: 43.24(2C), 42.30, 31.94, 29.73(3C), 29.70, 29.69, 29.66, 29.56, 29.38, 29.34, 29.06, 28.53, 28.2, 25.44, 22.71, 14.14; HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C20H41S{[M-Cl-]+}313.607 5, found 313.607 7。

1.3 凝胶阻滞实验

(1) 质粒扩增

质粒gWiz-GFP含有5757 bp，在感受态DH-5α大肠杆菌细胞(E.coli)按照TIANGEN感受态细胞操作步骤重组质粒与大肠杆菌。将重组后的E.coli在LB液体培养基中培养12 h，将生长好的菌液于10 000 r·min-1离心30 min，弃去上清液，所得菌体按照Qiagen EndoFree Plasmid Kit试剂盒操作步骤提取质粒，所得质粒用TE溶解，用Nano drop测定质粒浓度，于-20 ℃保存，待用。

(2) 阳离子脂质体/DNA复合物的制备

将合成的8种硫阳离子化合物分别用甲醇配制成浓度为7.7 nmol·μL-1和30.8 nmol·μL-1的溶液待用。将质粒gWiz-GFP配制成0.2 ug·μL-1的水溶液待用。

取不同量的阳离子脂质体溶液7.7 nmol·μL-1(0.3 μL， 1.0 μL， 3.4 μL)， 30.8 nmol·μL-1(1.1 μL， 1.6 μL， 2.7 μL， 3.0 μL)分别与0.2 ug·μL-1的DNA溶液3.0 μL混合，涡旋震荡10 s后于室温下放置15 min，得到硫磷比(S/P)分别为1/1， 9/1， 14/1， 18/1， 27/1， 45/1， 50/1的阳离子脂质体/DNA复合物。

(3) 凝胶电泳实验

称取0.35 g琼脂糖于100 mL烧杯中，加入35 mL三羟甲基氨基甲烷醋酸缓冲液(TAE)，配制成1%的琼脂糖凝胶。加热使琼脂糖完全融化，在室温下冷却至60 ℃，加入0.3 μL溴化乙锭(EB， 1 mg·mL-1)，摇匀后倒入有机玻璃槽中，插好梳子，待凝胶完全凝固后，取下梳子，将制好的凝胶放入电泳槽中。

将0.2 ug·μL-1的DNA(3.0 μL)和配置好的阳离子脂质体/DNA复合物，与相应体积的羟乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPE)缓冲溶液(5 mmol·L-1, pH为7.5)混合，形成总体积为8.0 μL样品，其中裸DNA为参照样品。将样品分别加入2.0 uL的溴酚蓝缓冲液，然后加到琼脂糖凝胶的孔中，在120 V电压下电泳20 min。最终使用凝胶成像仪对DNA在凝胶中的迁移进行分析。

2 结果与讨论

2.1 合成

本实验选用四氢噻吩、四氢噻喃为原料，通过SN2反应与碘代烷取代，合成含有正电荷的锍类化合物，产物通过氯离子交换树脂，使锍化合物结合氯离子为阴离子对照离子。

2.2 凝胶阻滞实验

质粒中电负性的磷酸根会使核酸在琼脂糖凝胶电场中向着正极方向移动，与阳离子脂质体复合后，电负性减弱，在凝胶电泳中移动减弱或阻滞。实验用琼脂糖凝胶电泳表征硫离子脂质体与DNA的结合能力。图1为四氢噻吩和四氢噻喃衍生物与gWiz-GFP复合后的凝胶电泳图。

图1 锍化合物与gWiz-GFP以不同比例复合后的阻滞实验的凝胶电泳图*

*a：S-丁烷基-四氢噻吩鎓氯盐；b：S-壬烷基-四氢噻吩鎓氯盐；c：S-十二烷基-四氢噻吩鎓氯盐；d：S-十六烷基-四氢噻吩鎓氯盐；e：S-丁烷基-四氢噻喃鎓氯盐；f：S-壬烷基-四氢噻喃鎓氯盐；g：S-十二烷基-四氢噻喃鎓氯盐；h：S-十六烷基-四氢噻喃鎓氯盐。M为Marker，1为裸DNA， 2～8为脂质体与gWiz-GFP混合物，比例分别为1/1， 9/1， 14/1， 18/1， 27/1， 45/1， 50/1。

由图1可以看出，S-丁烷基-四氢噻吩鎓氯盐(图1a)和S-丁烷基-四氢噻喃鎓氯盐(图1e)与DNA没有显示结合能力，质粒显示为游离质粒；其他脂质体化合物与DNA能形成复合物，且每个化合物随着脂质体/DNA比例增大，与脂质体结合的DNA增加，延滞现象明显增强。

脂链的长度对DNA的复合能力影响较大，碳链增长，与DNA复合能力增强、需要的摩尔比逐渐缩小。最短的丁基化合物没有显现复合能力，壬烷基在45 ∶1时开始表现复合能力，十二烷基符合能力较强，在14 ∶1时表现复合能力，十六烷基的复合能力较弱，主要原因是十六烷基的疏水性降低化合物的溶解度，在化合物加入到DNA水溶液中时，部分十六烷基化合物沉降析出，因此无法有效复合DNA。

比较四氢噻吩环和四氢噻喃环对DNA的复合能力，从图1中显示五元环和六元环没有明显差别。

首次合成以硫正离子为主体的阳离子脂质体，用于复合DNA。化合物的合成选用四氢噻吩和四氢噻喃与不同碳链的碘代物反应制备，反应直接、产率较高。用凝胶电泳阻滞实验初步表征，该类化合物能有效复合DNA，四氢噻吩环和四氢噻喃环对复合能力影响不大，碳链的长度对复合能力影响明显，碳链越长，复合能力越强。以硫正离子来构建阳离子脂质体，用于DNA复合，可以用于基因转染，进一步的实验测试即将开展。

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Synthesis and DNA Condensing Properties of Novel Sulfonium Compounds

WU Chun-yang, WU Chen-yue, ZHANG Ying, YU Li-yun, LI Jing*

(College of Life Science and Biotechnology, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing 163319, China)

A new type of cationic lipid composed with sulfonium as the positive charge was reported. The sulfonium compounds were synthesized starting from tetrahedrothiophene and tetrahedrothiopyran by reaction with lipid iodides in the presence of silver tetrafluoro borate. The products were treated with chloro type anion exchange resin to give eight novel sulfonium chloride compounds. The structures were characterized by1H NMR,13C NMR, FT-IR and HR-MS(ESI). Gel retardation experiments showed that the sulfonium compounds can condense DNA and form the lipopolyplex effectively. The results revealed that compound with longer lipid chain have stronger condensing effect.

tetrahedrothiophene; tetrahedrothiopyran; lipid iodide; sulfonium compound; cationic lipid; DNA complex; synthesis； DNA condensing property

2016-10-21

国家自然科学基金资助项目(31400660)； 黑龙江八一农垦大学大学生创新创业训练计划项目(2011310028)

吴春阳(1991-)，女，汉族，黑龙江大庆人，硕士研究生，主要从事分子合成及药物研究。 E-mail: anjingyang@outlook.com

李婧，副教授， E-mail: lijingroea@sina.com.cn

O624.7; O622.7

A

10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2017.01.16267