夹心法免疫层析试条的数学模型与仿真研究

曾念寅+朱盼盼+李玉榕+姜海燕+褚芦涛+杜民

摘 要 基于夹心法免疫层析试条检测原理，结合对流扩散方程和流体动力学方程，建立了夹心法免疫层析试条动态反应过程的数学模型，并通过COMSOL软件对试条动态反应过程进行仿真。分别探究了目标待测物A浓度在0～20 mol/L，标记物P浓度在1 × 10 2～1 × 103 mol/L以及硝酸纤维素膜的孔隙率 在0～1范围内变化时，检测线上夹心复合物浓度关于位置和时间的浓度变化情况，并分析了各物质初始浓度以及试条结构对于检测结果和检测时间的影响。结果表明，在一定浓度范围内，目标待测物A以及标记物P浓度的增加将提高试条的定量检测性能，而孔隙率通过影响混合液流速和混合液中各物质反应接触情况来影响检测结果。

关键词 免疫层析试条； 夹心法； 对流扩散； 数学模型； 生化反应过程

1 引 言

免疫层析测定（Lateral flow immunoassay， LFIA） 是基于抗原抗体特异性反应和层析技术发展起来的一项新兴、简便快速的免疫检测技术，具有特异性强，操作简单，可以单人份检测以及无污染等优点[1～3]。由于符合现代医学倡导的“床边检验” （Point.of.care testing， POCT） 的发展潮流，免疫层析试条品种日益增多，应用领域越来越广，主要包括有临床诊断、食品安全检测、环境检测、农业以及一些新兴领域比如分子诊断等[1～5]。

近年来，越来越多的研究者们关注和研究提高免疫层析试条的检测性能的方法，主要研究包括有：（1）大量生物化学研究者通过改进制备技术和层析材料复合方式、受体固定方式等，提高试条检测灵敏度和定量检测性能[6～10]；（2）搭建基于光电/图像的检测系统采集免疫层析试条的检测信息实现定量检测[11～15]。 针对生物化学研究者们在改进和提高试条特性时，尚无数学模型，而只能依赖反复尝试， 本研究组前期工作中， 基于免疫层析试条的反应机理及贝叶斯理论，建立其非线性状态空间方程模型，能够描述试条中各物质动态反应过程，优化试条性能，通过模型实现动态定量测定[3，16～20]。

Qian等[21，22]根据免疫层析试条反应机理以及对流扩散方程初步建立了数学模型，该模型能够检测试条系统中各参数对试条性能的影响，辅助优化设计试条。基于此，本研究依据免疫层析试条反应原理，结合对流扩散方程和流体动力学方程，建立模型，描述试条动态反应过程，并通过COMSOL软件对试条动态反应过程进行仿真，分析了试条中各物质初始浓度和试条硝酸纤维素膜孔隙率等对试条性能以及检测结果的影响。此模型能够有助于研究者们通过快速且低成本的方法设计和优化试条，为改善试条检测灵敏度和定量检测性能创造条件。

2 夹心法免疫层析试条的数学模型

夹心法免疫层析试条原理如图1所示[1，3]。在一片塑料片上，从左到右、首尾互相衔接地依次粘贴如下组分：样本垫 （Sample pad）、玻璃纤维膜的结合释放垫 （Conjugate pad），膜上固定着干燥的标记的特异抗体/抗原、硝酸纤维素膜 （Nitrocellulose membrane），膜上包被线条状的抗体/抗原，即线状的检测线 （Test line） 与质控线 （Control line）、吸水垫 （Wicking pad）。

为了简便，建模时先不考虑质控线，用A表示样本中的目标待测物，P表示结合释放垫处的标记物，R表示检测线上的抗体。各物质的浓度都可以视为关于空间一维位置（x）和时间（t） 的相关函数，如[A]（x，t）表示A在时间t时位置x处的浓度。本研究将免疫层析试条的动态反应过程分为两个过程： 在结合释放垫的标记过程和在检测线上形成夹心复合物过程。

在结合释放垫的标记过程形成复合物发生的生化反应式：

P+Aka1k d1PA（1）

基于对流扩散方程[21]反应（1）中的物质浓度变化如下：

3 数学模型的约束条件与环境设置

免疫层析试条中各物质的生化反应除了需要满足如上建立的数学模型的物质传递规律外，还需满足一定的流体流动规律。首先，样本液在试条中流动反应需满足质量守恒定律，即：

4.1 待测目标分析物[A0]对复合物[RPA]的影响

首先通过改变待测目标分析物浓度[A0]， 得到[RPA]在不同[A0]时关于时间的曲线如图2所示，由图2可见， [RPA]在开始阶段随着时间的增加呈线性快速增大，并随着反应的进行[RPA]慢慢饱和。因此，根据仿真结果可以选择一个具有较好特性的时间点作为免疫层析试条的检测时间。

为了更好地观察，基于图2的结果选择了3个固定时间来分析[RPA]跟与[A0]的关系，如图3所示。当待测物浓度较低时，[RPA]与[A0]呈正相关，但是当到达一定浓度后，随着[A0]的增加，[RPA]反而下降，这与免疫层析试条系统中存在Hook效应吻合[1，3]。

4.2 标记物[P0]对复合物[RPA]的影响

考察了[P0]对于检测结果的影响，得到[RPA]在不同[P0]下关于时间的曲线，如图4所示。在[P0]浓度较低时，[RPA]增长速率缓慢，且趋于一个偏小的数值，待测分析物没有得到完全反应；在[P0]浓度较高时，[RPA]增长的速率几乎相同；而且[P0]增加到某数值后，[RPA]的增长

速率和稳定值都基本保持不变。因此，[P0]浓度在一定程度上会影响试条的检测范围和检测结果。

如果在忽略反应（9）的情况下，则[RPA]由[PA]直接转化而来，可以用[RPA]/[PA]表征标记复合物在检测线上的转化程度，在t=10 min， [A0]=10 mol/L时， 得到的结果如图5所示。当[P0]浓度较低时，[RPA]/[PA]几乎随着[P0]的增加而呈线性增加。当标记物[P0]超过一定值时，[RPA]/[PA]将达到最大值，此时[PA]的转化情况最好；当[P0]超过该值继续增加，

[RPA]/[PA]略有下降，这可能是由于检测线上R的结合能力有限导致的。

4.3 硝酸纤维素膜上的孔隙率对试条反应的影响

考察了试条硝酸纤维素膜上的孔隙率对流过试条中混合液的流速的影响。从图6可见，硝酸纤维素膜上孔隙率越小，孔径越细，越有利于样本液的流速。分析孔隙率对生成[RPA]的影响（图7）可知，孔隙率对[RPA]的浓度影响不大。为了更好地分析孔隙率的影响，进一步得到了[RPA]/[PA]与孔隙率的变化关系。如图8所示，孔隙率影响了样本液在试条中移动的速度和样本液中各物质的反应程度。孔隙率较小时，PA能以相对较快的速度转化为RPA，进而使[RPA]/[PA]的值在同一时间内以较快的速度攀升。但并不是孔隙率越小越好，如果孔隙率太小，样本液在试条中的移动速度过快，导致标记混合物来不及与包被在检测线上的抗体结合，也影响检测效果。

5 结 论

基于夹心法免疫层析试条的反应机理与对流扩散方程建立其动态反应过程的数学模型，并用COMSOL软件对模型进行仿真分析试条中各个参数对检测结果的影响。得到的主要结论如下： （1） 通过模型优化试条的参数能够使生成的夹心复合物浓度与待测的目标分析物浓度成正比，但需要注意试条的检测范围，从而避免试条出现Hook效应。（2） 结合释放垫上的标记物浓度较小时，生成的夹心复合物浓度能与之成正比，但当其达到一定值后，标记物浓度的增加将不利于夹心复合物的生成。（3） 检测线上包被的抗体浓度的增加有利于夹心复合物的转化。 （4）硝酸纤维素膜上的孔隙率较小时，有利于样本液的流动和样本液中各物质的充分混合；而相对较大的孔隙率，则有利于样本液与检测线上包被的抗体更充分的结合，因此，选择合适的材料和控制孔隙率对于试纸条的性能也很重要。

References

1 Wong R C， Tse H Y. Lateral Flow Immunoassays. New York： Humana Press， 2008： 1-19

2 Yager P， Edwards T， Fu E， Helton K， Nelson K， Tam M R. Nature， 2006， 442（7101）： 412-418

3 Zeng N， Wang Z， Li Y， Du M. IEEE Transact. Biomed. Engineer.， 2011， 58（7）： 1959-1966

4 Zeng N， Li Y， Du M. J. Adv. Biomed. Engineer. Technol.， 2015， 2： 46-50

5 ZENG Nian.Yin， LI Yu.Rong， DU Min. Biomedical Engineering Research， 2015， 34（4）： 259-264

曾念寅， 李玉榕， 杜 民. 生物医学工程研究， 2015， 34（4）： 259-264

6 ZHOU Yao.Feng， XIONG Si.Cheng， JIANG Hu， DUAN Hong， XIONG Yong.Hua， Andrew Wang. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（12）： 1837-1843

周耀锋， 熊斯诚， 江 湖， 段 宏， 熊勇华， Andrew Wang. 分析化学， 2015， 43（12）： 1837-1843

7 XIE Yan.Jun， YANG Ying， KONG Wei.Jun， YANG Shi.Hai， YANG Mei.Hua. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（4）： 618-628

谢艳君， 杨 英， 孔维军， 杨世海， 杨美华. 分析化学， 2015， 43（4）： 618-628

8 DUAN Hong， CHEN Xue.Lan， JIANG Hu， SHEN Jun， DONG Sheng.Ming. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（3）： 338-343

段 宏， 陈雪岚， 江 湖， 沈 骏， 董胜明. 分析化学， 2015， 43（3）： 338-343

9 An B G， Kim H R， Kang M J. Anal. Chem.， 2016， 927： 99-106

10 Qu H， Yue Z， Qu B， Hui K， Qin G. Biosens. Bioelectron.， 2016， 81： 358-362

11 Chuang L， Hwang J Y， Chang H C， Chang F M. Clin. Chim. Acta， 2004， 348（1）： 87-93

12 Faulstich K， Gruler R， Eberhard M， Lentzsch D. IVD Technol.， 2007， 13（6）： 47-5312

13 Huang L， Zhang Y， Xie C， Qu J， Huang H. Optik.Inter. J. Light Electron Optics， 2010， 121（19）： 1725-1728

14 Li J J， Ouellette A. L， Giovangrandi L， Cooper D E， Ricco A J. IEEE Transact. Biomed. Engineer.， 2008， 55（5）： 1560-1571

15 Zeng N， Wang Z， Zineddin B， Li Y， Du M. IEEE Transact. Med. Imaging， 2014， 33（5）： 1129-1136

16 Zeng N， Wang Z， Li Y， Du M， Liu X. IEEE/ACM Transact. Comput. Biol. Bioinformatics， 2012， 9（2）： 321-329

17 Zeng N， Wang Z， Li Y， Du M， Liu X. IEEE Transact. Nanotechnol.， 2012， 11（2）： 321-327

18 Zeng N， Wang Z， Li Y， Du M， Cao J， Liu X. IEEE Transact. Biomed. Engineer.， 2013， 60（12）： 3418-3424

19 Zeng N， Hung Y S， Li Y， Du M. Expert Sys. Appl.， 2014， 41（4）： 1708-1715

20 Zeng N， Wang Z， Zhang H， Alsaadi F E. Cogn. Comput.， 2016， 8（2）： 143-152

21 Qian S， Bau H H. Anal. Biochem.， 2003， 322（1）： 89-98

22 Qian S， Bau H H. Anal. Biochem.， 2004， 326（2）： 211-224

Abstract A mathematical model of sandwich.type lateral flow immunoassay （LFIA） is established to describe the dynamic process of LFIA according to the biochemical principle of LFIA together with the convection.diffusion equations and the hydromagnetic equations. Based on the established model， the COMSOL software is utilized to simulate the dynamic process of LFIA. The simulation results not only demonstrate the relationships between the concentration of the sandwiched substance and the position or the time， but also analyze the influences of the initial concentrations of all substances and the structure on the performance of LFIA system when the target analyte A is from 0 to 20 mol/L， reporter particle P is from 1 × 10

2 mol/L to 1 × 103 mol/L and the porosity is from 0 to 1. Especially， within a certain concentration range， the increasing concentration of target analyte A and reporter particle P will enhance the quantitative performance of LFIA， and the porosity affects the result by controlling the flow rate of the test mixture and the material contact in the mixture.

Keywords Lateral flow immunoassay； Sandwich.type； Convection.diffusion equation； Mathematical model； Biochemical reaction process