犬心丝虫内共生体-沃尔巴克氏体DNA检测

朱晓静 ， 王金花 ， 廖承红 ， 徐永昊 ， 韩 谦

(海南大学热带农林学院 ， 海南 海口 570228)

犬恶丝虫病是由蚊子传播的线虫类丝虫病，能对其终末宿主-家犬(犬属)和野生犬科动物(山狗和狼等)造成严重的心肺疾病，除犬外，猫和其他野生肉食动物均可作其终末宿主。动物的感染病例已出现在除南极洲以外的各大洲，在热带和亚热带地区广泛流行，且流行时间比温带和寒带长。由于蚊虫是本病的传播媒介，特别是在热带地区，蚊虫一年四季都很活跃，而海南地处热带地区，该病几乎可全年流行。在我国的北京、上海、重庆、广东、福建、浙江、湖北、四川、云南、山东、辽宁、内蒙古和深圳等27个省和直辖市已有犬恶丝虫感染动物的报道[1]。而人患该病的确诊病例数呈逐年上升趋势，2005年在中国有2 例人体感染犬恶丝虫病例[2]。而到了2012年，香港有3例人感染了新型犬恶丝虫病病例[3]，犬恶丝虫病已成为潜在的严重威胁人类健康的新发人兽共患寄生虫病。但迄今为止，未见到海南犬心丝虫病流行病学的相关报道。

沃尔巴克氏体(Wb)是共生于犬恶丝虫体内的内共生菌，在丝虫发育的各个阶段均存在，当犬恶丝虫死亡后，向机体释放出大量的Wb，在心丝虫病治疗前减少沃尔巴克的水平有利于减少丝虫引起的不良病理反应，故Wb为犬恶丝虫的致病机理以及诊疗提供了新的研究途径，开发新的诊断工具来检测Wb是建立更有效的心丝虫诊断、治疗和控制不良反应的新方法。

目前Wb被报道的基因序列有wsp基因、过氧化氢酶基因、16S rRNA和沃尔巴克丝状热敏感蛋白基因(ftsZ基因)。ftsZ基因在沃尔巴克氏体中调节细菌细胞分裂，有着保守的和高度分散的序列，可作为细菌分类的基础[4]。

本试验基于PCR和凝胶电泳的技术，扩增犬心丝虫沃尔巴克氏体ftsZ基因，间接诊断犬的外周血的犬心丝虫感染，旨在探寻心丝虫病早期诊断技术，同时了解和证实海南省海口市犬心丝虫的感染情况和犬心丝虫内共生体Wb基因分型情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料 血样采集来自与海南省小动物流浪狗中心、海口市诺康宠物医院和海口市乐宠宠物医院。

1.1.1 试剂 Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒，SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。

1.1.2 仪器 离心机：上海手术器械厂生产；坩浴锅；PCR仪；移液枪；紫外分析仪；琼脂糖水平电泳仪；泡沫低温箱。

1.2 血液DNA的提取 取50 μL的血液样品加入到1.5 mL离心管中，再加入150 μL PBS使总体积为200 μL，混匀。加入20 μL Proteinase K，混匀。再加入200 μL的Buffer CL，震荡混匀，56 ℃水浴 10 min。向上述离心管中加入200 μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2 min，再10 000 r/min(室温)离心1 min，倒掉收集管中废液。将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 μL CW1 Solution，10 000 r/min离心 30 s，倒掉废液。将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 μL CW2 Solution，10 000 r/min离心30 s倒掉废液。将吸附柱重新放回收集管中，于 12 000 r/min(室温)离心2 min，离心去除残留的CW2 Solution。将吸附柱盖子打开于室温放置 5 min。取出吸附柱，加入一个新的1.5 mL离心管中，加入50 μL ddH2O静置3 min，12 000 r/min(室温)离心 2 min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步试验或-20 ℃保存。

1.3 目的基因PCR扩增 采用PCR扩增犬心丝虫沃尔巴克丝状热敏感蛋白基因(ftsZ基因)，片段520～580 bp，扩增引物参照国外文献报道的序列引物[8]。上游引物ftsZF为: 5′-ATAACAGCAGGAATGGGTGGT-3′; 下游引物ftsZR: 5′-TCACGCACTCTATTTGCTGCA-3′。PCR 反应总体积为25 μL, 包括1 μL模板, 10.5 μL双蒸水(ddH2O)，12.5 μL mix酶，1 μLftsZ基因引物。94 ℃ 变性4 min 进入循环, 94 ℃ 45 s, 52 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s，35个循环后72 ℃延伸7 min。将PCR产物进行电泳, 用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 溴化乙锭染色，于紫外灯下观察。每次试验都设立空白(水)对照, 并采取严格措施以避免污染，出现预期大小的条带，采用胶回收DNA 片段，-20 ℃保存备用。

1.4 序列测定与亲缘性分析 PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 登录美国国家生物技术信息中心(NCBI) 站点后，利用“Blast Sequence Similarity Searching”工具，将测序结果与GenBank中注册的ftsZ基因相关核苷酸序列(见表1)进行同源性比较。用MEGA 3.1 软件neighborjoining 法构建系统发育树。

表1 用于ftsZ基因分析的相关序列

2 结果

2.1 基因扩增结果及测序结果 共检测犬血60份，犬心丝虫沃尔巴克氏体阳性3份，阳性率5.0%。测序结果目的片段长度为544～560 bp。电泳图见图1。

图1 阳性标本PCR扩增电泳

注：M：DNA DL-2 000 的Marker； 1～3：阳性样本，其中1为haikou 1 hao，2为haikou 2 hao，3为chengdu 1 hao； 4：空白对照

2.2 基因亲缘性分析结果 将犬心丝虫沃尔巴克氏体ftsZ基因序列与GenBank 中注册的核苷酸序列进行比较, 结果发现，本次调查犬感染的犬心丝虫沃尔巴克氏体(Hainan 1hao)与GenBank中注册的犬心丝虫沃尔巴克氏体(AY523519.1)的同源性最高。构建的系统发育树也显示海南省犬感染的心丝虫沃尔巴克氏体与成都的犬感染的心丝虫沃尔巴克氏体聚在一个分支上, 而Dirofilariarepens、Dipetalonemagracile、Onchocercaochengi等都聚在外围, 见图2。序列分析表明, 本次调查的海南省海口市犬所感染的沃尔巴克氏体均属于D.immitis基因型而它们之间又并不是完全相同，在系统发育树上虽然聚在一个大的分支上, 但在大分支上又有小的分支，而且遗传距离各不相同。Hainan 1 hao 和成都发现的chengdu 1 hao基因型最近，而hainan 3 hao 与成都的基因型最远，并且hainan 1 hao 与hainan 3 hao 的基因型差距也较远。

图2 基于犬心丝虫沃尔巴克ftsZ基因构建的系统发育树

3 讨论

我国的犬心丝虫调查工作开展较早，在我国的北京、上海、深圳、贵州、重庆、广东、福建、浙江、湖南、四川、云南、山东、辽宁、内蒙古和吉林等27个省和直辖市已有犬恶丝虫感染动物的报道。但在海南开展相关的工作却较晚，2014年，贾丽欣首次用商品化的爱得士商品化胶体金免疫诊断试剂盒检测到了海南8只犬感染了心丝虫病[5]。近年来，在犬恶丝虫病的诊断和防治研究上已取得了系列成果，免疫学如酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断技术近年来在本病的研究上不断完善，具有高度特异性和敏感性，越来越多地被应用于该病的临床检测。然而商品化诊断试剂盒却存在以下问题：对5个月龄以下的犬不易检出；心脏寄生成虫少于5条时因血中抗体量较小，易出现假阴性；同时, 在自然感染犬恶丝虫的犬中有10%～67% 为单性感染，不能产生微丝蚴，这些仍然是该诊断中的一个难点[6]。国内外也有许多关于犬恶丝虫病检测的其他方法的报道，如：有微丝蚴虫体检测、皮内变态反应试验、直接凝聚试验、间接血凝试验、琼脂扩散试验、补体结合试验、荧光抗体标记技术、PCR法等。目前诊断该病所采用的方法中，微丝蚴检查法操作简单、容易判断，但容易出现假阴性。皮内变态反应试验、直接凝聚试验、间接血凝试验、琼脂扩散试验、补体结合试验等方法操作复杂。

而PCR的检测方法具有较高的灵敏性和特异性，在该病的诊断上具有良好的应用前景。

沃尔巴克氏体是共生于犬恶丝虫体内的共生菌，在丝虫发育的各个阶段均存在，它诱导的免疫病理引起的炎症反应是丝虫感染后致病的主要原因之一[7]，当犬恶丝虫死亡后，向机体释放出大量的Wb会加剧犬的炎性反应，在心丝虫病治疗前减少沃尔巴克的水平有利于减少丝虫引起的不良病理反应，故Wb为犬恶丝虫的致病机理以及诊疗提供了新的研究途径，成为了治疗犬恶丝虫病的靶位点[8]。开发新的诊断工具来检测Wb是建立更有效的心丝虫治疗方案和控制不良反应的新方法。

本试验在海南海口市以家犬为实验动物，在犬类全血样品中检测到了犬心丝虫沃尔巴克氏体的沃尔巴克丝状热敏感蛋白基因(ftsZ基因)的特异核苷酸片段，从分子生物学的角度证实和发现了海口市存在犬心丝虫沃尔巴克氏体及其基因型，认为该地区为犬心丝虫病的潜在疫源地。并且犬感染心丝虫率高达5.0%，不仅反映出犬是海南省海口市犬心丝虫的重要宿主动物之一，也说明在犬心丝虫疫源地调查中利用犬作为指示动物具有重要的价值和意义。

海南本地犬感染犬心丝虫沃尔巴克氏体虽然都属于D.immitis基因型，但它们在系统发育树矩形框的距离之间仍存在着一定差异，反映了海南省海口市D.immitis型沃尔巴克氏体基因的多样性较高。而我们本次试验采用的试验样本均来自小动物流浪狗中心和宠物医院，说明这些试验样本极有可能受到比较复杂的环境因素影响，但是这是否确实与复杂的地理和气候环境、宿主动物等因素有关，或者它们如何受影响的，还有待于进一步研究证实。相对而言，它们与我国四川发现的D.immitis型较为接近。在进化树中，遗传距离与地理分布间无明显规律，可能由于沃尔巴克氏体的基因型比较复杂，媒介、宿主比较多样，地理分布与基因型之间的关系需在今后的研究中继续探索。

这些分子生物学的技术，可以对心丝虫的早期感染进行诊断。而且，虽然大多数物种中都存在沃尔巴克氏体，但是随着不断进化，寄主与沃尔巴克氏体的相互影响，沃尔巴克氏体渐渐进化出许多个超群，通过研究不同物种中沃尔巴克氏体的基因亲缘性关系，可以为治疗丝虫病找到新的研究方向。

[1] 沈杰，黄兵.中国家畜家禽寄生虫名录[M]. 北京: 中国科学技术出版社，2004：110.

[2] 王中全，崔晶.恶丝虫病[J]. 国外医学(寄生虫病分册), 2005,32(2): 53-60.

[3] 国升·一种新型的寄生虫病-犬恶丝虫病[J]．人人健康, 2012(19):29.

[4] Godelc，Kumars, KoutsovoulosG,etal．The genome of the heartworm,Dirofilaria immitis,reveals drug and vaccine targets[J]．Faseb J,2012,26(11):4 650-4 661.

[5] 贾丽欣,林德贵. 吡虫啉和莫西菌素混合滴剂对预防犬心丝虫的临床效果[C].中国畜牧兽医学会小动物医学分会第八次学术研讨会暨第一届东北三省、内蒙古、天津小动物医师大会论文集,大连.2014:82.

[6] Nagorny S A. Biological characteristics of the causative agent of dirofilariasis in dogs in the Rostov Region](Article in Russian)[J]. Med Parazitol(Mosk)，2009,3：7-10.

[7] 刘梅，杨光友.人和动物丝虫共生菌-沃尔巴克氏体研究进展[J].动物医学进展，2015.36(4):87-91.

[8] McCall J W, Genchi C,Kramer L,etal. Dzimianski, M T, Supakorndej, P,Mansour, A M, McCall, S D, Supakorndej, N, Grandi, G, Carson, B. Heartworm andWolbachia: therapeutic implications[J]. Veterinary Parasitology, 2008,158:204-214.

[9] William M. Parasitic Disease s of Wild M ammals [M]. 2nd ed. Manson: The Veterinary Press,2001: 460-536.