幼龄大鼠环磷酰胺免疫抑制模型中血液学和肠道黏膜免疫指标的观察

许江城 ， 刘 斌 ， 蔡京美 ， 金孟燮 ， 佘锐萍

(1.中国农业大学动物医学院 ， 北京 海淀 100193 ; 2.北京韩美药品有限公司 ， 北京 顺义 101312)

免疫抑制动物模型在新药开发与评价中广泛使用，现有研究多使用成年动物建模[1-2]。由于幼龄个体与成年个体在药物代谢和药效方面不完全一致，使用幼龄动物模型进行研究和评价幼龄个体用药已经成为共识并得到各国药物监管机构的推荐。

目前幼龄大鼠免疫抑制模型的相关报道较少。参考成年动物研究[3-5]，观察本课题组建立的幼龄大鼠环磷酰胺(CYP)免疫抑制模型，探索血液学和肠道黏膜免疫指标变化特点，为模型今后的应用提供更多数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雌性4周龄SD大鼠60只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。饲养在北京韩美药品有限公司动物房屏障环境内(许可证号：SYXK(京)2015-0013)，试验经IACUC委员会批准，独立通风笼架(IVC)饲养，自由采食和饮水。

1.2 仪器和试剂 仪器：SYSMEX XT-2000i血液分析仪，日立7020生化分析仪。试剂：希斯美康血液分析试剂，美康生化分析试剂，PAS染色试剂盒(Sigma公司,395B-1KT)，环磷酰胺单水合物(东京化成工业株式会社)，sIgA一抗(北京博奥森生物技术有限公司，bs-0645R)。

1.3 试验分组 环磷酰胺免疫抑制模型组随机选取30只雌性4周龄SD大鼠口服给与环磷酰胺30 mg/kg体重隔1日共2次，剩余30只编入对照组。

1.4 体重和临床观察 自第一次给药起，共观察14 d。临床观察包含死亡数，一般健康状况和毒性症状。每日称量大鼠体重并记录(n=10)。

1.5 血液学指标检测 第2、4、8、15天，测定红细胞数(RBC)、白细胞总数(WBC)、嗜中性粒细胞数(NEUT)、淋巴细胞数(LYMPH)、嗜酸性粒细胞数(EO)、嗜碱性粒细胞数(BASO)、单核细胞数(MONO)和网织红细胞数(RET)。

1.6 血清生化指标检测 4 d时测定丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(T-BIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、肌酐(CREA)、血清尿素氮(BUN)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(T-CHO)、血清葡萄糖(GLU)。计算得到白球比例(白球比，A/G=白蛋白/球蛋白)和球蛋白(GLO，总蛋白-白蛋白)。

1.7 小肠肠道黏膜免疫指标的检测 15 d大鼠剖检取材，计数小肠派氏结(Peyer′s Patch, PP)后中性多聚甲醛固定。肠道石蜡切片H.E.染色后光镜检查，记录5个视野内5根肠绒毛的长度宽度和隐窝深度，100个上皮细胞之间的淋巴细胞(Intraepithelial lymphocyte, IEL)数。PAS染色记录不同肠段内5根绒毛内100个上皮细胞之间的杯状细胞(Goblet cell，gc)数。sIgA免疫组化染色记录5个视野内分泌型免疫球蛋白A(secretory IgA))阳性区域面积。

1.8 数据采用x±s表示，使用GraphPad PRISM®6.0版本软件进行数据间差异显著性分析，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体重变化与临床表现 试验期间模型组大鼠未见死亡与异常表现。对照组大鼠体重增加(105.8±6.0，205.5±16.9 g：d1，d14)，模型组大鼠体重虽增加但增长缓慢(106.7±4.5，171.4±8.9 g：d1，d14)。自4 d起体重与对照组相比显著下降(P<0.05)，4 d降幅15%而14 d降幅17%。

2.2 血液学指标的变化 如表1所示，4周龄大鼠与对照组相比多项血液学指标显著下降(P<0.05)，但变化趋势各有特点。白细胞总数降幅最高为第8天(81%)，第15天时部分恢复。嗜中性粒细胞数降幅最高为第8天(82%)，第15天恢复并增加16%。淋巴细胞降幅最高为第8天(84%)，第15天时仍降低35%。单核细胞第4天时为最大降幅(96%)，第8天是恢复至正常水平，第15天时升高62%。红细胞仅8天时显著降低，第15天恢复，网织红细胞第4天是最低，第15天时超过对照组水平。

表1 模型中幼龄大鼠血液学指标的变化

注：Con(对照组)，CYP(环磷酰胺模型组)。*：P<0.05，模型组与当日对照组相比

2.3 血清生化指标的变化 如表2所示，4周龄大鼠第4天时血清球蛋白与对照组相比显著降低(P<0.05)。肝功(ALT，AST，ALP，A/G，T-BIL)、肾功(CREA，BUN)、心肌(CK，LDH)、代谢(TG，T-CHO，GLU)相关指标均在机体正常范围内且无病理变化。

2.4 小肠肠道黏膜免疫指标变化 如图1所示，小肠段PP数量与对照组相比显著下降(P<0.05)，上皮内淋巴细胞数量显著降低(P<0.05)，杯状细胞数量显著降低(P<0.05)。如中插彩版图2所示肠道sIgA阳性面积降低，肠道sIgA分泌量减少。肠绒毛发育指标中肠绒毛高度、绒毛宽度及隐窝深度与对照组相比无明显影响，与对照组均无明显差异。

表2 模型中幼龄大鼠血清生化指标变化

注：Con(对照组)，CYP(环磷酰胺模型组)。*：P<0.05，模型组与当日对照组相比

图1 幼龄大鼠肠道黏膜免疫指标的变化

A：PP数量显著下降； B：IEL数量显著降低； C：gc数量显著降低。

*：P<0.05， **：P<0.01，模型组与对照组相比

3 讨论

环磷酰胺是一种无活性的前药，在体内代谢后发挥细胞毒性作用。免疫抑制作用多表现为生长抑制，外周血细胞数量减少，免疫器官萎缩，免疫细胞功能抑制等[1,4-6]。环磷酰胺造成的免疫抑制在成年动物模型中已有众多报道，而使用幼龄大鼠建立的免疫抑制模型和其免疫抑制特点研究还非常缺乏。此阶段动物建立的模型适用于评价低年龄段个体的用药情况。

SD大鼠在4周龄时正处于一个非常快速的生长发育阶段，除体重增长明显外白细胞数量也较高[7]。本试验发现4周龄幼龄雌性大鼠在CYP免疫抑制模型中表现出以下变化特点：大鼠生长发育抑制，外周血中白细胞总数、嗜中性粒细胞数与淋巴细胞数和单核细胞数显著减少。其中淋巴细胞恢复速度最慢，单核细胞回升最快并代偿性增高超过对照组水平。血清GLO降低说明抗体水平下降。模型中，固有免疫水平和获得性免疫水平均受到抑制。固有免疫水平在15 d时恢复程度较获得性免疫高。

图2 杯状细胞与分泌型IgA的变化

▲： 杯状细胞 ； ●：sIgA免疫组化阳性颗粒A： 对照组gc ； B： CYP模型组gc数量降低 ； C： 对照组sIgA阳性区域 ； D： CYP模型组sIgA阳性区域面积减少

肠黏膜免疫屏障是机体防御系统重要组成部分，有研究报道CYP可以引起成年大鼠PP以及gc数量减少[8-9]，本试验发现幼龄动物的表现与成年动物相类似。在PP、gc显著减少的同时，IEL数量与sIgA的量也较对照组显著下降。证明肠道黏膜免疫水平如同外周血细胞一样也受到CYP较强的抑制作用。而小肠绒毛的发育(长度、宽度和隐窝深度)则未见显著影响。

综上所述，4周龄雌性SD大鼠在模型中表现出显著的生长迟缓与血液固有免疫水平和获得性免疫水平降低，而未见其他毒性和副作用。其中白细胞及其分类细胞数量和PP数量变化显著、检测便捷、免疫抑制相关性高，推荐在模型使用中优先选择。幼龄大鼠免疫抑制后的变化特点，为模型在低龄儿童或动物药品、保健食品、化妆品、农药等研发或评估中的应用提供数据支持。

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