牛膝多糖对炔雌醚致大鼠生精损伤的保护作用研究

毛晨龙 ， 李 健 ， 陈耀星 ， 饶 冲 ， 赵会斌 ， 薛佳祺 ， 赵战勤

(1.河南科技大学动物科技学院 ， 河南 洛阳 471003 ； 2.中国农业大学动物医学院，北京 海淀 100193)

炔雌醚(Quinestrol)是一种化学合成雌激素，用于乳腺癌与前列腺癌治疗、女性避孕药和鼠类不育剂。通过多种途径进入环境，已经成为最重要的环境内分泌干扰物之一。研究发现，炔雌醚干扰下丘脑-垂体-睾丸轴的分泌功能，诱导氧化应激，造成生精细胞凋亡，生殖器官萎缩，精子质量下降，严重破坏雄性生殖功能[1-2]。生殖系统，尤其是睾丸内的生精细胞对氧化应激非常敏感，因此，提高机体的抗氧化功能，有利于改善雄性动物生殖功能[3]。大量研究发现，植物多糖具有显著的抗氧化功能。其中，牛膝多糖是从中药牛膝根中提取的一种生物活性多糖，具有抗氧化功能、抗肿瘤、免疫调节等作用，在养殖业已被广泛用作绿色环保型饲料添加剂[4-5]。目前，关于牛膝多糖对雄性生殖功能的保护作用机制尚不十分明确。因此，本文开展牛膝多糖对成年大鼠生殖器官发育、抗氧化功能和精子品质影响的研究，揭示牛膝多糖对生殖系统的保护作用，为探寻绿色、安全、天然的生殖功能保护药材提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物处理 20只8周龄成年雄性封闭群SD大鼠，购自河南省实验动物中心，平均体重260±20 g。饲养条件，12 h光照-黑暗周期，20 ℃～22 ℃，湿度40%。适应饲养1周，随机分为4组，进行灌胃药物处理，每天1次，连续1周。对照组：橄榄油+生理盐水；第二组：100 mg/kg体重牛膝多糖；第三组：1.0 mg/kg体重炔雌醚；第四组：1.0 mg/kg体重炔雌醚+100 mg/kg体重牛膝多糖。炔雌醚溶于50 μL橄榄油，牛膝多糖溶于0.2 mL生理盐水。试验结束后，取睾丸、附睾、精囊腺和前列腺称重，制作睾丸切片，进行苏木精-伊红(H.E.)染色和Tunel染色。Tunel染色结果棕黄色判定为阳性，统计1 000个生精细胞中阳性细胞数。睾丸匀浆检测抗氧化酶活性。GSH-Px、SOD、T-AOC、MDA和NO检测试剂盒，购自上海安迪生物科技有限公司。

1.2 样品处理与检测 取左侧附睾尾检测精子质量。采用细胞计数板统计精子数量(106/mL)。精子涂片采用姬姆萨氏染色检测精子形态和顶体完整率(%)。

1.3 数据统计 数据采用SPSS18软件包进行单因素方差分析(One Way ANOVA)，多重比较(LSD)，数据以“均值±标准差(Mean±SD)”表示，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 生殖器官和睾丸生精小管组织结构 与对照组相比，炔雌醚处理组睾丸、附睾、精囊腺和前列腺重量分别下降25.33%、50.78%、40.34%和41.49%(表1)，差异极显著(P<0.01)。与炔雌醚组相比，炔雌醚+牛膝多糖组睾丸、附睾、精囊腺和前列腺重量显著升高(P<0.01)但仍显著低于对照组(P<0.01)。牛膝多糖组生殖器官重量与对照组接近，差异不显著。

表1大鼠生殖器官重量与生精细胞Tunel表达的变化

分组睾丸/g附睾/g精囊腺/g前列腺/gTunel炔雌醚+牛膝多糖2.73±0.34A0.85±0.19B0.87±0.22B0.76±0.17B154.5±27.53B炔雌醚(1)2.27±0.26B0.63±0.15C0.71±0.17C0.55±0.11C273.8±32.57A牛膝多糖(100)3.12±0.35A1.24±0.22A1.28±0.21A0.97±0.20A113.2±26.47C对照组3.04±0.26A1.28±0.18A1.19±0.25A0.94±0.15A124.44±20.25C

注：数据表达为平均值±标准差。肩标大写字母不同表示差异极显著(A and B:P< 0.01)， 下表同

对照组生精小管充满大量生精细胞，管腔内有长形精子(见中插彩版图1 A)。炔雌醚组生精小管萎缩，细胞数量减少，大量细胞皱缩，管内少见精子(见中插彩版图1 C)。与炔雌醚组相比，炔雌醚+牛膝多糖组生精小管稍微萎缩，细胞较多，管腔内有精子(见中插彩版图1 D)。牛膝多糖组与对照组相比，睾丸组织结构无明显变化(见中插彩版图1 B)。

图1 大鼠睾丸生精小管组织结构变化与Tunel表达

A-D苏木精-伊红(H.E.)染色； E-H：Tunel染色。A，E：对照组； B，F：100 mg/kg牛膝多糖； C，G：1 mg/kg 炔雌醚；D，H：1.0 mg/kg 炔雌醚 + 100 mg/kg牛膝多糖．A-H：标尺= 100 μm．sg：精原细胞； sc：精母细胞； sp：精子细胞。

2.2 Tunel表达 牛膝多糖组和对照组每1 000个生精细胞中凋亡细胞数量分别为113.2个和124.4个(图1E-1H；表 1)。炔雌醚组凋亡细胞数量升高至273.8，差异极显著(P<0.01)。炔雌醚+牛膝多糖组凋亡细胞数量下降至154.5，显著低于炔雌醚组(P< 0.01)；但仍显著高于牛膝多糖组和对照组(P<0.01)。

2.3 精子质量 炔雌醚造成精子数量、活性和顶体完整率下降49.45%、40.74%(P<0.01)和16.54%(P<0.05)，畸形率升高48.03%(P<0.01)(表2)。精子畸形包括精子头部、体部和尾部畸形；头部畸形分为头部过大、无定形及双头等；体部畸形分为弯折、残缺等；尾部畸形分为弯折、卷曲及缺失等。与炔雌醚组相比，牛膝多糖+炔雌醚精子数量和活性均升高(P<0.01)，畸形率升高27.39%(P<0.01)。牛膝多糖单独处理组与对照组相比，精子品质无显著变化。

2.4 抗氧化酶活性变化 对照组睾丸SOD、GSH-Px和T-AOC活性分别为142.63 U/mL、50.12 U/L和12.14 U/mL；MDA和NO含量分别为4.58 nmol/mL和11.56 μmol/ L(表3)。牛膝多糖组抗氧化酶活性有所提高，差异不显著。与对照组相比，炔雌醚组抗氧化酶活性下降，MDA和NO含量升高，差异极显著(P<0.01)。与炔雌醚组相比，炔雌醚+牛膝多糖处理显著升高抗氧化功能。

表2炔雌醚与牛膝多糖对精子质量的影响

分组精子数量(106/mL)精子活性/%畸形率/%顶体完整率/%炔雌醚+牛膝多糖60.2±8.86B60.8±7.22B27.3±5.05a74.4±7.52a炔雌醚41.5±4.84C44.8±8.65C37.6±6.64a68.1±8.70b牛膝多糖82.5±9.65A77.2±9.34A23.7±4.82b84.5±7.83a对照组82.1±10.12A75.6±8.52A25.4±5.56b81.6±9.58a

注：数据表达为平均值±标准差。肩标小写字母不同表示差异显著(a and b:P<0.05)

表3炔雌醚与牛膝多糖对睾丸抗氧化功能的影响

分组超氧化物歧化酶谷胱甘肽过氧化物酶总抗氧化能力丙二醛一氧化氮炔雌醚+牛膝多糖128.65±28.37A42.38±6.23A9.44±2.48B5.28±1.63B15.48±3.52B炔雌醚88.62±25.65B27.26±5.81B6.68±1.37C7.28±1.65A24.35±6.23A牛膝多糖150.34±24.75A52.28±5.32A12.58±2.26A4.07±0.58B10.42±2.16C对照组142.63±28.54A50.12±6.04A12.14±2.15A4.58±0.62B11.56±2.57B

3 讨论

3.1 牛膝多糖对成年雄性大鼠生精细胞凋亡的调节作用 炔雌醚是一种合成的脂溶性雌激素，通过污水排放和动物排泄物进入环境，是最重要的环境内分泌干扰物之一[6]。炔雌醚造成大鼠、小鼠及蒙古沙鼠睾丸、附睾、精囊腺、前列腺重量、精子数量及质量等下降，并破坏氧化-抗氧化系统平衡、抑制生殖激素分泌[1]。牛膝多糖作为一种绿色天然的抗氧化剂，能够增强抗氧化功能、调节细胞凋亡。崔培等研究发现，牛膝多糖显著提高肝脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和溶菌酶(LZM)活性[7]。本研究发现，牛膝多糖抑制炔雌醚造成的大鼠睾丸氧化应激和生精细胞凋亡，改善睾丸组织结构、增加睾丸、附睾、精囊腺和前列腺的重量，增加附睾内精子数量，减少畸形率，提高精子活性。牛膝多糖抑制炔雌醚对雄性生殖的破坏作用可能归功于其对抗氧化酶活性的调节作用。

3.2 牛膝多糖对雄性大鼠睾丸抗氧化状态的调节作用 机体内SOD、GSH-Px、维生素、三肽及还原剂等可清除活性氧和脂质过氧化物，维持氧化-抗氧化系统平衡；一旦该平衡被打破，氧化应激将发生，诱发生精细胞凋亡，降低精子质量，破坏雄性生殖功能。本试验结果显示，炔雌醚诱导氧化应激，促进生精细胞凋亡，牛膝多糖显著提高大鼠睾丸SOD、GSH-Px和T-AOC活性，降低NO和MDA含量，缓解炔雌醚诱导的氧化应激，减少炔雌醚诱导的生精细胞过度凋亡，抑制炔雌醚对抗氧化功能的破坏作用。有研究发现，牛膝多糖上调Bcl-2和Survivin表达，下调Fas、bax 和p53表达降低，减少肾、视网膜和脑细胞凋亡[8-9]。本结果表明，牛膝多糖增强大鼠抗氧化功能，抑制生精细胞凋亡可能是其调节雄性生殖功能的重要途径之一。本研究首次发现牛膝多糖缓解炔雌醚引起的大鼠抗氧化功能下降、生精细胞凋亡和精子品质异常，发挥对雄性生殖功能的保护作用，有助于探寻防治生殖功能损伤的新调控途径和中药制剂开发。

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