月季花纯露提取的最佳工艺及有效成分的验证

王 珍，郑 霞，周琛彦，赵 莹

（连云港师范高等专科学校海洋港口学院，江苏连云港222006）

月季花又称“月月红”，在中国已有两千多年的栽培历史，种植面积十分广泛。因花期较长、花色丰富、价格低廉、观赏价值高，月季花被广泛用于园林绿化。月季花还可以入药，从中提取的香料具有活血调经、消炎解毒的作用[1]。此外，月季花还有活血美容的功效，被越来越多地应用到美容保健中[2]。纯露又叫水精油，是在提炼精油的过程中分离出的饱和蒸馏原液，为精油提炼的副产品[3-4]。纯露呈透明液体状，除了含有少量的精油成分以外，还含有水溶性物质，成分天然，香味清淡。相比于精油，纯露低浓度的特性使肌肤更容易吸收而受到现代人的追捧，是不可或缺的日常美容护肤用品[5-7]。笔者采用旋转蒸馏法提取月季花纯露，是对高宏建的水蒸汽蒸馏法[8]的进一步改进，在提取过程中进行单因素实验与正交实验，分析实验结果并找出月季花纯露提取的最佳工艺，同时对实验所提取的纯露进行有效成分的验证。结果表明，采用薄层色谱方法来验证月季花纯露的有效成分，方法简单有效，快速便捷。

一、供试材料

原料：月季花，市场上购置的月季花纯露。

器材：旋转蒸发器（型号为RE52-99，上海亚荣生化仪器厂）、电热恒温鼓风干燥箱（型号为DHG型，上海精宏实验设备有限公司）、电子称（型号为JJ3000，常熟市双杰测试仪器厂）、硅胶薄板（HSGF254）、烧杯、量筒、研钵、冰箱、标签纸、滴管、16 目筛、容量瓶、培养皿、玻璃棒、药匙、一次性手套、透明小袋。

试剂：蒸馏水、石油醚、乙酸乙酯、乙酸、二苯胺、苯胺、磷酸、醋酸乙酯、丁酮、甲酸、氯化铝、乙醇，以上试剂均为分析纯。

二、实验方法

（一）月季花的预处理

将采集到的月季花放至干燥箱中以40℃烘48h（注意翻面，花与花之间要有一定的间隔，不能靠到箱体，以防烘焦）。烘干后用研钵将月季花粉碎，过16目筛子，制备多份样品。每份样品用电子称准确称取3.00g，放入冰箱冷藏备用。

（二）月季花纯露的提取

取样品一份，置于500mL烧杯中，加入一定量的石油醚（沸程60℃－90℃）和水并充分搅拌混匀，静置、浸提一定时间。将旋转蒸发仪连接完整，打开电源，然后将浸提液与月季花粉末一起倒入旋转蒸发仪的料液瓶中，打开冷凝水装置，让冷凝水充满冷凝器，在水浴锅操作面板上设置水浴锅的温度。取出加料的橡皮塞，打开真空泵，抽走系统里的空气后盖上橡皮塞，使整个系统处于密封的状态。调整转速，蒸馏20min。将蒸馏后的浸提液和月季花粉末再加入第一次浸提的一半量的水和石油醚浸提，再次蒸馏。将两次蒸馏收集到的蒸馏液混合再蒸馏一次，量取最后所得蒸馏液的体积。实验结束，先关闭加热开关与旋转开关，使旋转瓶上升，打开橡皮塞，关闭真空泵与电源，最后关闭冷凝水开关。

（三）单因素实验

1.料液比

按照 1：5、1：15、1：25、1：35、1：45、1：55 的料液比（g/mL），依次量取 10mL 石油醚与 5mL、35mL、65mL、95mL、125mL、155mL蒸馏水混合于500mL烧杯中，取6份样品分别加入上述比例的混合液中进行第一次浸提。浸提60min后，在蒸馏温度70℃中蒸馏20min，进行第一次蒸馏；然后将料液比、浸提时间和蒸馏时间分别减半进行二次蒸馏，将两次的蒸馏液混合进行第三次蒸馏，最后用量筒量取蒸馏得到的纯露的体积。

2.浸提时间

浸提时间从混合料液开始到倒入旋转瓶为止。取6份样品，分别放进料液比（g/mL）为1：25的混合液（10mL石油醚和65mL蒸馏水混合，置于500mL烧杯中）中，浸泡 20min、40min、60min、80min、100min、120min。在蒸馏温度70℃中蒸馏20min，进行第一次蒸馏，第二次、第三次蒸馏方法同上，最后用量筒量取蒸馏得到的纯露的体积。

3.蒸馏温度

蒸馏温度的设定与浸提所添加的石油醚的沸程有关。本次实验所用石油醚的沸程为60℃-90℃，所以蒸馏温度设定为 60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃，蒸馏后用量筒量取所得纯露的体积。

（四）正交实验

为了发现提取月季花纯露的最佳工艺条件，在单因素实验的基础上，以料液比、浸提时间、蒸馏温度设计并进行三因素、三水平正交实验。

（五）月季花纯露中有效成分的验证

纯露的有效成分含量很少，采用颜色反应方法对其进行定性分析结果不显著，因此采用薄层色谱实验法验证月季花纯露有效成分，方法简单有效，快速便捷。薄层色谱实验的主要原理是根据各组分在溶剂中的溶解度的不同、吸附剂对样品各组分的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列的斑点[9-10]。与高效液相色谱法相比，薄层色谱实验法有明显的优势。制备高效液相色谱柱比较困难且费用较高，而薄层层析的操作比较快捷、简单，具有灵敏度高和准确可靠等特点，因此常用于实验室研究[11]。所以，本次实验采用薄层色谱实验法来验证提取的月季花纯露中是否含有糖类物质。

1.月季花纯露中糖类物质的验证

点样。用铅笔在硅胶薄板上距离底边1.5cm的地方划一条直线，作为点样的位置（注意划线时不能将薄层戳破，否则会影响后面的展层）。在直线上用0.3×100mm的点样毛细管吸取实验制备的纯露后点样，将点样的斑点直径控制在2mm左右，不能过大。待第一次点样的斑点完全干燥后，在原斑点的地方进行第二次点样，可以用吹风机使点样斑点加速风干。这是因为纯露中有效成分的含量较少，只进行一次点样展层显色后没有明显效果。经过反复实验证明，点样8次效果最佳。点样次数过少，有些成分分离不出；点样次数过多，会产生较严重的拖尾现象，分离效果不好。按同样的方法点样鉴定购买的月季花纯露。

展层。将之前配制的展开剂（乙酸乙酯、乙酸、水按照体积比2：1：1配制）倒在培养皿中，将点样的硅胶薄板的一端放入展开剂中，注意展开剂液面的高度不能超过点样时所做的标记线，盖上烧杯，使整个展开层析的装置处于一个密封的环境，样品从底端开始展层，待展开剂到达距离薄板顶部大约1cm时取出层析板，同时用铅笔在顶端记录最终展开的距离，用吹风机烘干。

显色。将1g二苯胺加入1mL苯胺中，等完全溶解后再加入50mL的丙酮，搅拌均匀后加入5mL的85%磷酸，一边滴加一边搅拌，直至溶液变透明没有浑浊为止[12]。最后将配制的显色剂转移至棕色试剂瓶中保存备用，避光保存防止试剂见光分解挥发变质。将配制好的显色剂倒入培养皿中，用镊子将烘干的薄板完全浸没于显色剂中，然后取出薄板，用电吹风烘干直至层析的斑点出现。我们将薄板完全浸没在显色剂中，而没有采用喷雾的方法显色，是因为喷雾法控制不好会影响最后显色的效果。

2.月季花纯露中黄酮类物质的验证

点样。用铅笔在硅胶薄板上距离底边1.5cm的地方划一条直线，在直线处用0.3×100mm的点样毛细管吸取实验制备的纯露后点样，控制斑点的大小，使直径保持在2mm左右。用吹风机加速斑点干燥，多次点样增加样品浓度。根据糖类物质鉴定的需要，同样点样8次。按同样的方法点样鉴定市场购买的月季花纯露。

展层。采用上述同样的方法展层，注意展层环境密封避光，点样的斑点不能进入展开剂（醋酸乙酯、丁酮、甲酸和水按体积比5：3：1：1配制）中，当展开剂距离薄板顶端大约1cm处时取出薄板，做好记号，用吹风机烘干。

显色。将展层完毕的薄板浸入显色剂（1%氯化铝乙醇溶液，1g氯化铝用乙醇溶解并定容至100mL）中；全程使用镊子操作，要小心谨慎，不能破坏薄层，取出后用吹风机加热烘干。

观察。黄酮的显色在自然光下无法观察，必须在紫外灯（365nm）下观察[13]。

3.月季花纯露中氨基酸的验证

配制氨基酸展开剂和显色剂。氨基酸展开剂用正丁醇、乙酸（30%的冰乙酸）和水按 4：1：1（正丁醇40mL，乙酸 10mL，蒸馏水 10mL）的比例配制，其中30%的冰乙酸可以按照3mL冰醋酸加7mL蒸馏水配制；显色剂用0.2%茚三酮-乙醇、0.2g茚三酮加0.2mL冰乙酸用无水乙醇定容至100mL配制而成，置于阴暗处保存。

点样。用毛细管吸取提取到的月季花纯露，在距硅胶板一端1.5cm处点样，吹干。

展开。先在培养皿中放入展开剂，将点样的硅胶板一端浸入展开剂，另一端靠在培养皿壁上，使硅胶板呈约30°倾斜，用大烧杯盖住培养皿，使得展开环境密闭，待展开剂前沿距离薄板顶端1cm处将硅胶板取出。

显色。将展好的硅胶板置于显色剂中，浸透后，取出，用电吹风完全吹干薄层，直至色斑出现为止。

计算Rf值。Rf=色斑中心至点样点中心的距离/溶剂前沿至点样点中心的距离。若点样一次显色后无色斑，可多次点样验证。

二、结果与分析

（一）单因素实验结果

1.月季花纯露提取的最适料液比

1：25的料液比可以使提取的月季花纯露质量达到最高，1：35次之。这是因为一定的料液浸泡可以使月季花中的水溶性物质充分溶出，质壁分离效果更好，从而达到更好的提取效果。随着料液比的增加，纯露的提取量逐渐下降，可能是因为月季花本身的水溶性物质挥发后就无法再蒸馏出来，料液比的增加使整个旋转瓶内混合液的有效物质比重减少，反而影响了蒸馏的速度（见图1）。

图1 料液比对月季花纯露提取的影响

2.月季花纯露提取的最佳浸提时间

浸提时间对月季花纯露提取的影响不显著，也呈现先升后降的趋势。浸提时间过长或过短都不利于纯露的提取，根据实验情况，最终确定最佳浸提时间是60min左右（见图2）。

图2 浸提时间对月季花纯露提取的影响

3.月季花纯露提取的最适蒸馏温度

纯露提取量随着蒸馏温度的增加呈现先上升后下降的趋势（见图3）。蒸馏温度的设定与添加的有机溶剂石油醚有关，因为此次实验使用的石油醚沸程在60℃－90℃，所以蒸馏温度必须在此范围内。由于热敏物质在温度的上升过程中容易损失，所以温度越高，纯露的提取量反而呈下降趋势；而温度过低时，内部的芳香物质不能完全提取出来，也影响纯露的提取量。为了能提取更多的月季花纯露，蒸馏温度控制在70℃左右比较合适。此外，过高的温度在实验过程中还会引起爆沸现象，为了实验的安全，应该选取适当的蒸馏温度。

图3 蒸馏时间对月季花纯露提取的影响

（二）正交实验结果及分析

为了确定在多因素条件下蒸馏温度、料液比、浸提时间与在单因素条件下实验的结果是否吻合，正交实验的料液比（g/mL）选择 1：25、1：35、1：45，浸提时间选择 40min、60min、80min，蒸馏温度选择 68℃、70℃、72℃（详见表 1）。

表1 正交实验因素水平表

由表2可以知道，各因素对纯露提取的影响根据极差 R 判断，11.6＞2.7＞2，即 C（蒸馏温度）＞A（料液比）＞B（浸提时间），由此得出结论，蒸馏温度是影响月季花纯露提取量最重要的一个因素，其次是料液比，而浸提时间对纯露提取量的多少影响最小。由极差的分析结果可知，月季花纯露的较优提取条件是A1B2C2，即料液比为 1：25（g/mL）、浸提时间 60min、蒸馏温度70℃，与单因素实验结果相吻合。

表2 正交实验结果分析表

（三）月季花纯露中有效成分的验证结果

1.糖类物质的显色结果

实验提取的月季花纯露在点样8次后呈现明显的斑点显色，结果见图4的A薄板。在点样次数相同的情况下，购买的纯露显色结果不明显，当点样次数加到10次后，呈现和A薄板相似的结果，结果见图4的B薄板。可以根据斑点的相对位置，计算Rf值。Rf=原点到薄层层析斑点中心的距离/原点到展层溶剂前沿的距离（Rf=2.8/6=0.467）。

采用不同的展层溶剂会影响到最后的Rf值，样品在固定相与流动相中不同的溶解度会影响Rf值的大小，若固定相中的溶解度大于流动相则Rf值偏小，反之则偏大。同时薄层的厚度、展层的距离、温度等都会影响Rf值的大小，所以不能仅仅依据Rf值鉴定未知的样品成分，但可以推测纯露中可能有葡萄糖、果糖等成分。

图4 糖类物质显色结果

2.黄酮类物质的显色结果

实验制备的纯露薄板点样8次后在紫外灯的照射下有荧光的斑点出现，如图5中的薄板A所示。而相同点样次数下市场购买的则没有斑点显色。根据公式计算：Rf=2.1/6=0.35，推测可能有花色素、槲皮素、山奈酚等成分。黄酮类物质是在纯露中所独有的，是植物精油中所不含的成分。黄酮类物质有抗氧化的作用，虽然含量微少，但是作用强大，是纯露有效成分中极其重要的组分。而市场购买的纯露在点样12次后有荧光斑点，如图5的薄板B所示，说明购买的纯露与实验制备的纯露相比，其黄酮化合物含量更甚微。

图5 黄酮类物质显色结果

3.氨基酸的显色结果

展开剂展出来的斑点为蓝绿色，点样次数为8次，如图6所示。Rf=色斑中心至点样点中心的距离/溶剂前沿至点样点中心的距离，根据公式进行计算：Rf=2.1/6=0.35。符合药典规范的范围0.2-0.8。

图6 氨基酸的显色结果

三、讨论

采用旋转蒸馏的方法提取月季花纯露，用正交实验探究影响提取因素的条件，料液比1：25（mL）、浸提时间60min、蒸馏温度70℃时为纯露提取的最佳条件。旋转蒸馏法比超临界CO2萃取方法操作简单，适合普通实验室操作，但是在提取率上不及其他蒸馏方法，这说明该提取方法值得进一步研究。此次月季花纯露提取采用的月季花都是干燥后的花，能够保证提取条件的统一。为了使芳香类物质不损失，最好采用新鲜月季花进行蒸馏提取[14]，但整个实验周期较长。

在对有效成分的鉴定过程中，没有发现一系列的斑点，可能与跑样的长度以及试剂的选择有关，如果采用气相色谱仪实验数据可能更准确。对于糖类，氨基酸和黄酮所测得的Rf值都符合药典规定，因此可以确定月季花纯露中含有这三种物质，且实验结果显示实验提取的纯露的有效含量略高于购买的纯露。纯露作为皮肤的调理剂，具有保湿、消炎、美白等功效，但是目前纯露的标准还没有明确的规范，市场上鱼龙混杂[15]，为了安全起见，建议消费者购买正规商家生产的纯露。

本实验对消费者在购买纯露时具有指导借鉴意义，因为操作、设备等问题，存在一定的误差，仍需要进行进一步的探讨。

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