丝状真菌基因敲除的研究现状

●路则宝

丝状真菌基因敲除的研究现状

●路则宝

基因敲除又称目标基因破坏或目标基因替换（Targeted gene replacement, TGR）。本文主要对近年来基因敲除在丝状真菌基因功能研究中的应用及优缺点作简要综述，以期为科研工作者提供一定参考。

基因敲除；同源重组；RNA干扰

基因敲除是自80年代末以来发展起的一种新型分子生物学技术，指对一个结构已知但功能未知的基因,从分子水平上设计实验，将该基因去除或取代，通过分析突变体表型而明确基因功能的方法。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。在DNA同源重组（homologous recombination, HR）基础上发展起来的这种TGR技术,在酵母与哺乳动物细胞中已有广泛应用。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用。

1 基因的插入突变

基因的插入突变主要是利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞[1]，根据细胞的不同，插入载体的选择也有所不同。逆转录病毒可用于动植物细胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA转化和转座子比较常用。

2 RNA干扰（RNA interference, RNAi）

RNAi引起的基因敲除则是因为少量的双链RNA就能阻断基因的表达，并且这种效应可以传递到子代细胞中，所以RNAi的反应过程也可以用于基因敲除，近年来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更为简单方便的方法。

3 丝状真菌遗传转化

目前应用于丝状真菌转化的方法有很多，常用的转化方法主要有：农杆菌介导转化、电击法、基因枪法、醋酸锂转化法、微注射法等。

3.1 农杆菌介导转化

近年来,AtMT成为丝状真菌转化发展趋势[2]，在适宜的条件下，A.tumefaciens可将外源DNA导入多种真菌和真菌组织，一些其他体系难于转化的真菌也可以通过AtMT转化，与基因枪法相比，AtMT效率更高，而且产生复杂转化子的数量少，AtMT转化相对简单，不需要制备原生质体既可以用于随机插入突变也可以进行TGR[3]。

3.2 CaCl2/聚乙二醇法

通常是在室温下，将原生质体置于10～50 mmol/L的CaCl2与高浓度的聚乙二醇中10～30 min。

3.3 电击转化

通常是将原生质体（有时用萌发的孢子）置于短暂的高电压之下,使细胞膜通透性增加，更易于摄取外源DNA。

3.4 基因枪法

在尚未建立原生质体转化或对于细胞壁成分缺乏了解的真菌，基因枪法是一种有效的转化方法；另外，对于大麦白粉病菌（Erysiphe graminis, DC）等无法分离培养的专性寄生菌，可以通过与感染的寄主叶片同时轰击进行转化。

4 各种方法特点比较分析

CaCl2/聚乙二醇法、电击转化在真菌中有广泛应用，但都存在一个局限,就是需要制备原生质体，原生质体制备[4]是一个复杂的过程，不同真菌细胞壁成分不同，原生质体制备所适用的酶的种类及用量都不同，因此很难用统一的体系来实现。基因枪法是将DNA包裹在金属或钨粒子的表面来轰击完整的真菌组织，与原生质体转化相比, 基因枪法具有相同或者更高的转化效率、整和度及遗传稳定性；可用于基因枪法转化的真菌组织相对较多，而能够用于制备原生质体的真菌组织是有限的，因此基因枪法具有优势，

综上所述，各种转化方法都能实现丝状真菌的TGR，目前，对上述方法进行直接比较的研究很少，一般认为AtMT和基因枪法更适合于TGR，其中AtMT效率相对更高。第一个被转化的丝状真菌是粗糙链孢霉，目前为止已有上百种丝状真菌转化成功，其中有许多种类可被具有不同选择标记的多种载体所转化。已转化成功的丝状真菌中有工业真菌（如黑曲霉、米曲霉等）、医用真菌（如产黄青霉、顶头孢霉）、植物病原真菌（如玉米黑粉菌、小麦全蚀菌等）、杀虫真菌（如白僵菌、绿僵菌）、真菌上寄生真菌（如哈氏木霉）、食用真菌（如裂褶菌、鬼伞等）、菌根真菌（如卷边桩菇、漆蜡蘑等）等[5]。

（作者单位：楚雄医药高等专科学校）

[1]陈其军,肖玉梅,王学臣,周海梦.植物功能组研究中的基因敲除技术[J].植物生理学通讯,2004,40:121-126.

[2] Jinkui Yang, Zebao Lu, Yiyong Luo,etal. Involvement of the putative G-protein α subunit gene pngpa1 in the regulation of growth, sensitivity to fungicides, and osmotic stress in Phytophthora nicotianae.Journal of African Microbiology Research,2012,6(3):680～689.

[3] Michielse CB, Arentshorst M, Ram AF, Hondel CA.Agrobacterium-mediated transformation leads to improved gene replacement efficiency in Aspergillus awamori [J]. Fungal Genetics and Biology, 2005,(42):9-19.

[4]宋爱环,李红叶,刘小红.指状青霉(Penicillum digitatum)原生质体制备和再生条件[J].农业生物技术学报,2004,(2):197-201.

[5]许杨,涂追.丝状真菌基因敲除技术研究进展[J].食品与生物技术学报,2007,26(1):120-126.

路则宝(1980～)，男，硕士研究生，讲师，研究方向为微生物与免疫学与教学。