药用植物浸制标本制作难点——花的保色

刘秀娟

（湖北中医药大学药学院，湖北武汉430065）

药用植物浸制标本制作难点
——花的保色

刘秀娟

（湖北中医药大学药学院，湖北武汉430065）

中药药用原植物浸制标本的制作过程中，花的保色一直以来是制作高品质浸制标本的难点。本文从花色呈色原理及内外环境影响因素着手，归纳了历年文献中记载的各类对花色影响的因素，结合代表性的保色技术，望能带来参考与启发。

药用植物；浸制标本；花色；保色；影响因素

原色植物浸制标本因其颜色形态结构贴近野外，在日常教学中占有举足轻重的地位，而作为植物鉴定要点的器官——“花”的保色，一直以来是制作高品质浸制标本的瓶颈。笔者通过历年文献的查找，现整理出花色呈色原理及影响因素与代表性的保色技术相结合，望能带来参考与启发。

1 花色

自然界中植物花色很多，不同植物体内化学成分差别很大，因此给中药浸制标本制作方法带来困难。花色色素存在于花瓣的表皮或接近表皮的几层细胞之中。花色包含类胡萝卜素、类黄酮和花青素3个类群组成。类胡萝卜素主要以结晶及沉淀存在与细胞质体中，故难溶于水。类黄酮为黄色系，花青素为红色系及兰色系，2者都易溶于水，存在于液泡中，并随酸碱性不同而发生颜色变化，类黄酮是酸性越强黄色越淡，反之越深；花青素在酸性下为红色，中性呈紫色，碱性呈兰色。

2 呈色原理

存在于植物表皮细胞液泡中的水溶性色素——花青素苷，是决定植物花色的重要色素之一，其生物合成由酶催化而成，不同种花青素苷的差异性主要体现在其基本骨架上不同位置的取代基，这些结构变化使植物器官呈现出不同的颜色[1]。花青素苷随着花的发育而慢慢积累，并在花瓣发育的后期大量生成。黄色花由类胡萝卜素和类黄酮二类色素显示；橙色花由花青素与类黄酮或类胡萝卜素组合产生；红色和粉色花以花青素为主体呈现；植物界中不存在白色色素，白色花瓣色素层中仅含有淡黄色的水溶性黄酮类物质，白色花瓣的细胞群体不规则排列在一起犹如海绵体，留下的空隙里面的空气形成小气泡，看上去感觉是白色，和看到水中气泡是白色一个道理，这也是为什么白色花瓣在水中长时间浸泡后，会逐渐变的透明的原因，就是因为作为白色实体的气泡被排挤出去的结果[2]。而蓝色花应具备[3]：1）飞燕草色素衍生而来的花色苷的积累；2）助色素黄酮醇或黄酮糖苷的积累；3）较高的液泡PH（PH＞5）。

3 结构

花青素结构中含有2个芳香环，B环仅含一个羟基时为粉红色或红色，2个羟基时为紫红色，3个为蓝紫色，随着羟基增多，紫色增加；羟基被甲基化时颜色又往红色转化。由此可知，花青素性质不稳定，给制作浸渍标本带来困难。花色素是含2苯基苯并吡喃阳离子的多羟基和甲基的衍生物，其以2-苯基苯并吡喃为单元，沿类黄酮修饰途径衍生出3种类型，即橙色的天竺葵素、红色的矢车菊素、紫色的飞燕草素，矢车菊素进一步甲基化形成芍药素，而飞燕草素则修饰为矮牵牛素和锦葵素，共6种主要的花色素（生色团）。他们主要以稳定的糖苷形式积累于花瓣表皮细胞的液泡中，形成花色，糖苷化可使花色变得浓艳、鲜明。自然界中有多达600种被分离和鉴定的花青素苷由以上6种花青素苷元衍生而来[4]。

4 花色影响因素

液泡PH值、助色素、金属离子等多种细胞内因素共同决定花青素苷在花朵中的最终呈色[5]。但是，花青素苷的合成及呈色还受外界环境条件的影响和植物自身发育状况的调节[6-7]。而影响花色苷降解的主要因素为PH、温度和氧浓度，其次为降解酶、抗坏血酸、氨基酸、二氧化硫、金属离子和糖及其降解产物等[8]。具有邻二酚羟基的花色苷，如矢车菊素、飞燕草素、牵牛素类花色苷较没有邻二酚结构的花色苷，如：锦葵色素，降解速率快的多。

4.1 内部因素

4.1.1 PH因为花色素骨架上的氧原子显示为4价，显碱性，而酚羟基显酸性，导致花色素的颜色在不同PH值下分子构型不一。花青素随溶液PH值的变化在假碱、醌型碱、黄盐阳离子、查尔酮这四种结构之间发生可逆改变：当PH低于2时，主要以红色烊阳离子存在；当PH在3到6时，则以无色假碱存在；在中性或微酸性情况下，以紫色中性醌式碱存在；当PH为8到10时，以蓝色醌式碱存在[9-10]。酸性条件下，风信子花色苷提取液呈鲜红色，随着PH逐渐升高，色素提取液颜色变淡，靠近中性时则呈淡紫色。刘春朝等人就对中药浸制标本制作工艺的改进中涉及到保存液PH的调整[11]。在健康的生理条件下，植物的花、果实或叶片细胞PH值通常为弱酸性或中性。花色素能稳定存在于酸性环境中，花色苷在强酸性环境内呈红色，性质更稳定；高PH的环境内偏蓝色，性质不稳定[12]。牡丹花干燥时，细胞内水分流失导致的PH值变化和细胞内酶的联合效应是牡丹花花瓣变色的2个重要因素[13]。液泡PH逐渐升高可使花青素苷呈现由红色向蓝色转变，如深红色月季花花瓣中液泡的PH值为4左右[14]。

4.1.2 酶植物所含的酚类在氧化酶及过氧化物酶的联合作用下，非常容易被氧化成黑色导致植物褐变。能够引起酶促褐变的反应底物有单宁类的儿茶酚及与儿茶酚类似的酚类物质。花色苷会依儿茶酚浓度的提高，降解速率加快。然而多酚氧化酶自身并不是花色苷降解的直接原因，而是在咖啡酸等酚类底物存在的情况下，领苯二酚会被氧化成苯醌结构，花色苷才会被苯醌氧化成为无色化合物。非酶褐变是氨基酸游离的氨基与含有羰基的化合物发生反应，生成氨、醛、二氧化碳以及羟甲基呋喃甲醛。随后，羟甲基呋喃甲醛可与氨基酸及蛋白质反应生成黑蛋白素。细胞膜膜质中不饱和脂肪酸过氧化会产生丙二醛MDA。细胞中MDA浓度的升高会导致膜渗漏，细胞衰老加快。而果蔬采摘后仍然是一个活体，不断进行着旺盛的生命代谢.热水加钙的处理方法较仅热水处理能进一步抑制果蔬的电导率、丙二醛MDA、褐变指数的上升，降低多酚氧化酶PPO活性，延缓呼吸速率的升高[15]。色素分解的整个进程都少不了氧化酶及过氧化酶。糖苷酶及多酚氧化酶是导致花色苷降解及失色的核心酶。烫漂则可破坏酶类的活性、防止酶引起褐变现象，稳定色泽。在高温环境下，酶蛋白凝固变性、活性降低，通常82℃时，所含的大多数酶活性消失，但是过氧化物酶、过氧化氢酶和脂肪氧化酶等耐热性较强，只有在更高的温度下才失活，如88℃下数分钟或100℃下约30秒。酶经热灭活钝化后，酶促反应则停止。烫漂还可导致蔬菜上部分的微生物死亡，同时还能去掉部分尘埃和杂质。85℃热处理是灭菌及灭酶活的最适宜温度[10]。在80～100℃条件下，蔬菜上的微生物大都受热死亡，减少后续制作标本过程中防腐成分的添加，使保存液成分尽量精简，减少各种成分之间的相互作用，影响保存质量。烫漂还可排除各种组织之间的空气，降低贮藏过程中植物的氧化作用。

4.1.3 辅色作用（1）分子内辅色作用：分子内基团起到的稳定作用；花色素的取代反应有甲基化、羟基化、糖基化和酰基化这4种。除羟基化会使花色苷稳定性降低，另外3种取代反应均能不同程度增强花色苷的稳定性。在酸性环境中，除了甲氧基化会导致花色苷呈色红移，连在糖苷配基B环上的羟基越多，花色越向紫移，糖基化和酰基化也具有同样的作用。这些取代基的类型、数目和所处的位置等对花色苷的稳定性具有重大影响。常见苷元稳定性[16]：矢车菊色素＞芍药花青素＞矮牵牛素＞锦葵色素=飞燕草色素.能与花色素结合形成糖苷的糖类主要有葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖等。而决定花色苷稳定性的糖基[17]：葡萄糖＞半乳糖＞阿拉伯糖。花色苷糖基化可促使外部糖基与水分子结合生成氢键，从而提高花色苷在水中的溶解度。4，5位的羟基反应可稳定花色苷、防止无色化合物的形成。添加某些芳香酸或脂肪酸可使花青素酰化，提高其稳定性，咖啡酸对花色苷稳定性最高，阿魏酸、对香豆酸次之[18]。在弱酸至中性环境中，酰化花色苷上的糖链可将有机酸折叠，使其处于2-苯基苯并吡喃环平面上，这种形态能较好地抵抗水分子所引发的一系列降解反应，防止花色苷降解为无色假碱或查尔酮，能较好地维持花青素溶液的色泽。而双酰基化花青素比单酰基化花青素稳定性高，是由于酰基表面的芳香族基团与花青素骨架之间的疏水作用所构成的层状结构——保护了夹在2个有机酸中间的花青素核。自然界中在中性或微酸性水溶液中较稳定的花色苷，通常都链接有2个以上的酰化糖苷基团，提高了花色苷水化失色所需的活化能，有效防止了无色假碱的生成[19]。

（2）分子间辅色作用：指与花色苷分子结构类似的花色苷或其他能与花色苷结合产生稳定作用的物质。无色的辅色素加入到花青素溶液后，能阻止花色苷的水化转换，使花色苷在中性或微酸性环境中呈稳定而亮丽的色彩。例如，通常飞燕草色素独存时呈紫红，只有在助色素类黄酮的存在下才呈蓝色，这种辅助着色作用有时还会有一个或多个金属离子参与[20]。辅色素固色的作用源于其抗紫外光的功能，当溶液中有游离辅色素时，会首先吸附紫外线，降低紫外线对花色苷的光损害，而当辅色素耗尽，花色苷则会失色加速。蓝紫色花中因含助色素异牡荆碱，故蓝紫色花色苷较稳定，褪色程度较紫红色轻。提高酰基化花青素占比和补充辅色剂可稳定花青素[21]。辅色素包括：单宁、多酚、核苷酸、有机酸、多糖、香豆素、蒽酮类、氨基酸、类黄酮、花色苷本身因属于多酚类物质，故也可作为自身的辅色剂。辅色素分子结构中富含电子的π平面结构与水竞争形成斥水中心，与花色苷在垂直方向形成三明治般的夹心形态，可以防止花色苷水解成易降解褪色的产物，免受亲核反应。若辅色素有糖基，则糖基通过氢键的相互作用还可提高聚合物的稳定性。原儿茶酸等苯酸类衍生物、咖啡因等生物碱、芦丁和槲皮素等黄酮醇以及单宁酸均可作为辅色素。但是辅色素本身水溶性不好，易沉淀，同时携带色素沉淀；水溶性好的辅色素与分子量较大的花色苷或以自我鳌合的2花色苷分子体再结合而出现大分子沉淀[22]。黄酮类辅色素对花色苷的辅色作用体现在对紫色脱水碱的稳定，阻止无色查尔酮的形成。不同辅色素与同一花色苷络合，呈色不同。加大花色苷的甲基化与糖基化的占比，则分子间辅色作用——共色效应增大。在同一PH与温度中，花色苷含量越多，辅色作用越显著——花色苷呈色增强。在PH1-7条件下，都可发生辅助成色作用。PH3-4或高浓度的中性水溶液中，花色苷会发生自聚作用[23]，稳定性得到提高，色泽加深。在PH7时，自聚与共色作用竞争。不同种类花色苷的络合导致花色苷水化平衡失色需要更多的活化能，间接防止了无色假碱的生成[24]。

4.1.4 金属花色苷B环上具有邻位羟基结构，如：矢车菊素、飞燕草素，能与金属离子络合而颜色更鲜艳，而锦葵素却不行。但是，仅在高PH，如PH=10时，花色苷B环上的羟基才能电离，与金属离子形成络合物，一旦生成不易逆转，且不易受PH值影响而变色，延长花青素苷的半衰期[25]。但是，不同金属离子对花色苷的作用不一，如：2价和3价铁离子和铜离子均使风信子花色苷变色，而镁离子对其无明显影响，钙离子和锌离子在高浓度时有增色效应[10]。钙作为细胞信号传递的一份子，不仅参与细胞分裂还连接和稳定膜结构中磷脂与蛋白质，其可通过调控酶的活性延缓细胞的衰老[26]。而宁小清[27]提出的植物保色AB液就是在刘若庸的多色杀生固定液的基础上增加了氯化钠和氢氧化钙，并调整PH至3，但是金属离子在稳定和保护花色苷的同时，形成的金属-单宁络合物可导致褪色[28]。实验发现[29]：随着铁离子浓度的增加，血橙花色苷的降解有小幅度的加速；铝离子对血橙花色苷有增色作用，且随浓度递增；低浓度的铜离子对血橙花色苷有保护作用，但高浓度则会加速花色苷的降解；铅离子会破坏花色苷的稳定性，当浓度高于0.005 mol/L，反应液出现明显白色沉淀，可能是铅离子与花色苷中的酚羟基相互作用产生。某些紫色花瓣郁金香品种的花被下部呈现蓝色，其蓝色区域与紫色区域具有相同的花青素苷和黄酮醇，液泡内PH值也很相似，但是蓝色区域铁离子浓度高于紫色区域25倍[30]。八仙花花色改变与铝离子有关：在红、蓝两色共存的八仙花品种中，蓝色花瓣细胞中铝离子含量高于红色花瓣40倍[31]。

4.2 外在因素

4.2.1 温度实验证明[10]高温对花色苷的影响效应大于光照。温度提高时，花青素苷合成速率降低，降解的速率却加快，直接导致花色苷含量减少[32]。在无氧条件下，花色苷降解速率主要与PH有关[29]；有氧情况下，花色苷的降解随温度的升高而加速。因为花色苷的失电子过程、水解及开环反应均是放热反应，故当升温时，反应平衡朝无色查尔酮及甲醇假碱形式转变，当降温和酸化时，除查尔酮很难转换为花色烊阳离子以外，醌式碱及甲醇假碱均能逆转为红色的花色烊阳离子。实验证明[27]，随着温度的升高以及加热时间的增加，花色苷降解速率逐渐增大的同时，紫红色溶液逐渐变淡，说明高温对花色苷物质具有褪色作用。低温下花色苷较稳定，但并不是说高温完全不行，比如：高温瞬时加热，对花色苷的损耗就几乎可以忽略。因花色素在110℃左右会分解，所以一般建议加工温度尽量低于60℃。

4.2.2 光——紫外线光敏氧化反应和光的降解作用较酶促氧化反应慢得多。但是，有研究表明[10]日光灯和自然光均会加速花色苷的氧化过程，因此花色苷的光稳定性较差。光照导致花色苷降解褪色同热降解类似，可能花色苷降解生成查尔酮，再进一步降解成苯甲酸等终产物。然而，光照也可增加在体花色苷的合成与积聚，是果实向阳面色泽艳丽的主要原因。有研究发现，蓝色花大多集中分布于高山地区，可能与高山地区紫外线强度较大有关[33]。UV-B对于花朵花青素苷呈色必不可少。

4.2.3 糖高浓度（＞20%）糖能导致多酚氧化酶活性降低，是由于水分活度降低导致花色苷向假碱式转化的速度变慢，故花色得到了稳定，但是低浓度（＜20%）糖却会导致花色苷的降解和变色加速。糖是否易于降解为糠醛类物质决定了糖对花色苷的降解能力。乳糖、果糖、山梨醇等较蔗糖、葡萄糖更容易导致花色苷的降解。实验证明[29]果糖对血橙花色苷的降解促进作用最强，因为其更容易转化为糠醛类物质；在酸性条件下，蔗糖可水解为果糖及葡萄糖。糖类物质在花的发育过程中占有举足轻重的地位。蔗糖含量的增加可促进花瓣伸长，甚至可以使离体的花朵花瓣呈色。在含不同糖浓度的保鲜液中，花瓣呈现的色彩也不一。

4.2.4 酸类维生素C被氧化后的过氧化氢能使花色苷开环生成查尔酮，导致花色苷降解。在铜离子存在的条件下，这种降解进一步加速。低温时，维生素C可稳定花色苷，高温时，维生素C会加快对花色苷结构的损坏。实验发现[25]，在红色的荔枝花色素苷溶液中刚加入0.25%维生素C时，有增色效应，但随着时间延长，吸光度逐渐下降，表明维C对花色素苷破坏较大。随着保存时间延长，含柠檬酸的花色苷溶液吸光值下降幅度较大，而酒石酸、乳酸、醋酸对未知花色苷稳定性较好，但是醋酸增色效果比酒石酸和乳酸差。而柠檬酸还可络合多酚氧化酶中心金属铜离子，使酶失活，继而阻止酶促褐变反应。

4.2.5 其它30 μg/g的二氧化硫可以阻止酶类对花色苷的降解作用却不会对花色苷产生漂白效果。但是花色苷与亚硫酸根离子的反应会增加细胞壁的渗透力，导致细胞内色素更易溶出。酒精等有机试剂会促使溶液中的水自由度增大，使水与花色苷的界面上水的亲核力加大。在花色苷溶液中加入乙醇，吸光值立刻降低。虽然辅色剂有稳定花色苷的作用，但是有机溶剂的加入可减弱辅色素的稳定作用。实验表明[34]，25 mg/L的槲皮素可减慢杨梅果汁花色苷的降解。

[1]Tanaka Y1，Ohmiya A.Seeing is believing:engineering anthocyanin and carotenoidbiosyntheticpathways[J].CurrOpinBiotechnol.2008Apr；19(2):190-197.

[2]梁祖霞.花的色彩之谜[J].科技潮，1998（3）：58-59.

[3]徐清燏，戴思兰.蓝色花卉分子育种[J].分子植物育种，2004，2（1）：93-99.

[4]Kong JM1，Chia LS，Goh NK et al.Analysis and biological activities of anthocyanins[J].Phytochemistry.2003 Nov；64(5):923-933.

[5]Yoshida K1，Mori M，Kondo T.Blue flower color development by anthocyanins:fromchemical structure tocell physiology[J].Nat Prod Rep.2009 Jul； 26(7):884-915.

[6]胡可，韩科厅，戴思兰.环境因子调控植物花青素苷合成及呈色的机理[J].植物学报，2010，45（3）：307-317.

[7]Hong Y1，Tang X2，Huang H，et al.Transcriptomic analyses reveal speciesspecific light-induced anthocyanin biosynthesis in chrysanthemum.BMC Genomics.2015 Mar 17；16:202.

[8]林欢，李修英，杜建.花色苷的研究进展[J].中国老年学杂志，2014，34（20）:5917-5919.

[9]孙建霞，张燕，胡小松，等.花色苷的结构稳定性与降解机制研究进展[J].中国农业科学，2009，42（3）：996-1008.

[10]唐东芹，徐怡倩，袁媛，等.理化因素对风信子花色苷稳定性的影响[J].南京林业大学学报（自然科学版），2016，40（4）：69-73.

[11]刘春朝，王春雷，董诚明.中药浸制标本制作工艺的改进[J].中医临床研究，2010，2（16）：22.

[12]Yamaguchi T1，Fukada-Tanaka S，Inagaki Y Genes encoding the vacuolar Na+/H+exchanger and flower coloration[J].Plant Cell Physiol.2001 May；42 (5):451-461.

[13]朱文学，钟丽娟，段续，等.牡丹花干燥过程中色变机理分析[J].干燥技术与设备，2007，5（3）:128-133.

[14]Tanaka Y1，Brugliera F，Kalc G，et al.Flower color modification by engineeringof the flavonoid biosynthetic pathway:practical perspectives[J].Biosci Biotechnol Biochem.2010；74(9):1760-1769.

[15]李香玉，张新华，李福军，等.采后热处理影响果蔬贮藏品质机理的研究进展[J].北方园艺，2011（5）：204-208.

[16]Trost K1，Golc-Wondra A，Prosek M，et al.Anthocyanin degradation of blueberry-aronia nectar in glass comparedwith carton during storage[J].J Food Sci.2008 Oct；73(8):S405-411.

[17]Ichiyanagi T1，Oikawa K，Tateyama C，et al.Acid mediated hydrolysis of blueberryanthocyanins[J].ChemPharmBull(Tokyo).2001Jan；49(1):114-117.

[18]李云，赵昶灵，杨晓娜，等.花色苷分子结构与其稳定性以及呈色关系的研究进展[J].云南农业大学学报，2010，25（5）：712-720.

[19]钟瑞敏.花色苷结构与稳定性的关系及其应用研究[J].韶关学院学报（自然科学版），2001，22（12）：79-83.

[20]Harborne JB1，Williams CA.Advances in flavonoid research since 1992[J]. Phytochemistry.2000 Nov；55(6):481-504.

[21]顾林，朱洪梅，顾振新.花青素的生物合成和成色机理及提高其稳定性的途径[J].食品工业科技，2007，28（11）：240-244.

[22]钟瑞敏，姚宝书.辅助色素对花色苷的稳定性应用研究——与纯单花色苷的辅色效果[J].食品研究与开发，1996，17（4）：14-17.

[23]Ellestad GA1.Structure and chiroptical properties of supramolecular flower pigments[J].Chirality.2006 Feb；18(2):134-144.

[24]吕峰，何洪巨，冯启利.蔬菜中的花色苷及其保健功能[J].中国食品与营养，2007（3）：47-49.

[25]姚伙旺，曾秋平，劳永民，等.食品添加剂对荔枝果皮花色素苷稳定性影响的研究[J].食品科学，2006，27（5）：152-156.

[26]赵倩倩，刘慧，王亚喆，等.稀土元素在植物学中的研究进展[J].食品研究与开发，2015，36（19）：176-179.

[27]宁小清，郭建华.植物绿色固定保色AB液的实验研究[J].广西中医学院学报，2005，8（1）:3-5.

[28]卢钰，董现义，杜景平，等.花色苷研究进展[J].山东农业大学学报（自然科学版），2004，35（2）：315-320.

[29]曹少谦，胡晓燕，潘思轶.血橙花色苷稳定性研究[J].食品科技，2010，35（12）：242-249.

[30]Shoji K1，Miki N，Nakajima N，et al.Perianth bottom-specific blue color development in Tulip cv.Murasakizuishorequires ferric ions[J].Plant Cell Physiol.2007 Feb；48(2):243-251.

[31]ItoD1，Shinkai Y，Kato Y，et al.Chemical studies on different color development in blue-and red-colored sepal cells of Hydrangea macrophylla[J]. Biosci Biotechnol Biochem.2009 May；73(5):1054-1059.

[32]Shaked-SachrayL1，Weiss D，Reuveni M，et al.Increased anthocyanin accumulation in aster flowers at elevated temperatures due to magnesium treatment[J].Physiol Plant.2002 Apr；114(4):559.565.

[33]胡可，韩科厅，戴思兰.环境因子调控植物花青素苷合成及呈色的机理[J].植物学报，2010，45（3）：307-317.

[34]陈健初.杨梅汁花色苷稳定性、澄清技术及抗氧化特性研究[D].杭州：浙江大学，2005:1-101.

The Nodus of Processing the Preparation of TCM Herb Soaking Specimen --The Color Retention of Flowers

LIU Xiujuan
(College of Pharmacy,Hubei University of Chinese Medicine,Hubei Province,Wuhan 430065,China)

In the process of the preparation of TCM herb soaking specimen,the color retention of flowers has been a tricky procedure in the presentation of high quality soaking specimen.With the presentation mechanism of flower colors and the influence factors of internal and external environment of petals,I sort out from the references over the years,and hope this paper could provide reference and elicitation for the further research.

TCM herb;soaking specimen;color;retention of flowers;influencing factor

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.14.064

1672-2779（2017）-14-0146-04

：杨杰本文校对：廖志航

2017-04-18）