高效液相色谱法测定阿奇霉素片含量的不确定度分析

张 竹

高效液相色谱法测定阿奇霉素片含量的不确定度分析

张 竹

目的为了验证测量值的准确性，对高效液相色谱（HPLC）法测定阿奇霉素片含量的不确定度进行分析。方法 通过建立HPLC法测定含量的数学模型，并根据《测量不确定度评定与表示技术规范》（JJF1059.1-2012）中有关规定评估其不确定度。结果分析不确定度影响因素，得出测量结果的扩展不确定度和置信区间。结论建立的不确定度评估方法适用于片剂类不确定度的分析。

阿奇霉素；不确定度；含量；高效液相色谱法

阿奇霉素片在《中国药典》2010年版二部[1]含量的检测方法由微生物效价测定更改为高效液相色谱（HPLC）法，更改幅度较大。为确保药品检验的准确性，保障人民用药的安全性，本研究对HPLC法测定阿奇霉素片含量的不确定度进行分析，找出各环节对不确定度的影响因素，最终建立适用HPLC法测定阿奇霉素片含量的不确定度方法，消除在实验过程中可能带来的误差，以提高测定数据的准确性及可信性。

1 仪器与试药

安捷伦液相色谱仪（1100，HPLC），紫外检测器，生产企业：美国安捷伦公司。梅特勒XA205电子天平；梅特勒S210型酸度计；生产企业：瑞士梅特勒-托利多仪器上海有限公司。供试品：阿奇霉素片，生产企业：山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司，批号：130801，规格：0.25 g。阿奇霉素对照品：中国药物检验制品研究院提供，批号：130593-201002，纯度：94.3%。

2 实验方法

2.1 对照品溶液的制备精密称取阿奇霉素对照品25 mg，用乙腈定容于25 ml量瓶中，制成1 mg/ml的对照品溶液，备用。

2.2 供试品溶液的制备取供试品20片，精密称定，研细，精密称取粉末适量（约相当于阿奇霉素250 mg），用乙腈定容于250 ml量瓶中，制成1 mg/ml的供试品溶液，摇匀，滤过，备用。

2.3 色谱条件WondaCractODS-2 C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），流动相为磷酸盐缓冲液（取0.05 mol/L磷酸氢二钾溶液，用20%的磷酸溶液调节pH值至8.2）-乙腈（45:55），体积流量为1.0 ml/min，检测波长为210 nm，进样量为50 μl，柱温为30 ℃。

2.4 测定方法分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各50 μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。

3 结果分析

3.1 数学模型根据《中国药典》2010版二部规定，含量计算公式：

式中X：阿奇霉素片的百分标示含量（%），At：供试品峰面积，Ws：对照品称样量（g），Vs：对照品定容体积，Ps：对照品纯度，M：平均片重（g），As：对照品峰面积，Wt：供试品称样量（g），Vt：供试品定容体积，C标：供试品标示量（g），rep：重复性。

3.2 不确定度来源分析

表1 引起不确定度的因素

3.3 各分量不确定度的评定

3.3.1 样品称量过程引入的不确定度u（m1）（B类不确定度）

3.3.1.1 样品的均匀性本实验依照JTF1135-2005《化学分析中不确定度的评估指南》[2]规定，将样品研磨后充分混匀随机取样，可认为样品是均匀的，代表性充分，由此所致的不确定度可忽略不计。

3.3.1.2 样品称量①天平校准不确定度（B类不确定度）：根据检定证书，分析天平的置信区间为±0.1 mg，按矩形分布，取包含因子K=3，则由此带来的不确定度分量值为：u1（m1）=0.1 mg/3=0.057 80 mg。

②称量重复性的不确定度（B类不确定度）：根据检定证书，未考虑样品或对照品特性对结果的影响，重复性误差为±0.2 mg，按矩形分布，取包含因子K=3，则由此带来的不确定度分量值为：u2（m1）= 0.2 mg/3=0.1156 mg。

ua（m1）=uc（m1）/A=0.1828 mg/298.9 mg=6.116×10-4

ub（m1）=uc（m1）/B=0.1828 mg/297.7 mg=6.140×10-4

取供试品20片，精密称定，求得平均片重为0.2990g/片，每片重量x1=0.2984、0.3005、0.2992、0.2988、0.2991、0.2984、0.2996、0.2983、0.2988、0.2991、0.2975、0.3012、0.2989、0.2981、0.2995、0.2986、0.2991、0.2972、0.3003、0.2994 g。

片重差异的标准不确定度[3]按贝塞尔公式计算：

片重差异引起的相对不确定度：

供试品质量的相对标准不确定度：

3.3.2 容量仪器校准引入的不确定度u（V25）u（V250）容量允差JJG196-2006规定[4]，20 ℃时25 ml容量瓶的A级容量允差为±0.03 ml，250 ml容量瓶的容量瓶允差为±0.15 ml。取三角形分布，则由此带来的不确定度分量为B类不确定度：

25 ml容量瓶标准不确定度：

250 ml容量瓶标准不确定度：

校准容量瓶环境温度所带来的不确定度为B类不确定度，根据公式Δv=（V×水的膨胀系数× ΔT=2.1×10-4×3，3 ℃差异），按矩形分布评定：

25 ml容量瓶带来的合成不确定度为：

两份对照品分别定容于两个25 ml容量瓶中，则对照品定容相对不确定度为：

urel（V25）=2u（V25）/V25=2×0.015 26/25= 1.221×10-3

250 ml容量瓶带来的合成不确定度为：

两份供试品分别定容于两个250 ml容量瓶中，则供试品定容相对不确定度：

3.3.3 供试品色谱峰面积的不确定度u（A1）（A类不确定度）含量测定时供试品溶液平行进样4针，

记录峰面积A为6695.375 73、6725.781 74，平均值6710.58 ，极差为30.41，取n=2时的极差系数C=1.13，用极差法计算[5-6]其标准不确定度相对标准不确定度urelA（A1）=4.021×10-3，B为6622.333 37、6645.866 21，平均值为6634.10，相对标准不确定度urelB（A1）=3.139×10-3。

供试品峰面积的相对不确定度：

3.3.4 对照品称量过程引入的不确定度u（m2）（B类不确定度）精密称取阿奇霉素对照品A为0.026 33g、B为0.026 73g，同3.3.1.2项则由天平称量带来的相对不确定度：

阿奇霉素对照品纯度为94.3%，纯度标准偏差为5.7%，按矩形分布，取包含因子K=，对照品纯度的相对不确定度为：

对照品质量的相对标准不确定度：

3.3.5 对照品色谱峰面积的不确定度u（A2）（A类不确定度）对照品溶液A重复进样5次，峰面积分别为6696.325 20、6709.389 28、6695.922 49、6686.120 48、6667.521 97，平均值为6691.06，RSD%= 0.23%，对照品溶液峰面积测量的标准不确定度：

对照品溶液B，进样2针峰面积分别为6819.931 76、6804.307 37，平均值为6812.12，相对标准不确定度为：urelB（A1）=2.030×10-3，对照品峰面积的相对不确定度：

3.3.6 高效液相色谱仪测量带来的不确定度u（s）（B类不确定度）高效液相色谱仪测量带来的不确定度是由质量技术监督管理局检定校准得出来的，检定证书（编号：YH171301168）给出的相对标准不确定度为：urel（s）=0.002

3.3.7 结果重复性的不确定度u（rep）（B类不确定度）该测量重复性标准偏差是本测量所有随机影响的合成[7]，因此其他不确定度来源中的随机分量不再考虑。取本品重复测量6次，测量值分别为99.51%、99.07%、98.61%、98.76%、99.36%、98.21%，平均值为98.9%。单次测量的标准不确定度为：u（rep）= 4.932×10-3，在日常检验中，测定两份样品报告平均值，故平均值的标准不确定度为：

平均值的相对标准不确定度为：

表2 各相对标准不确定度分布情况

3.4 合成不确定度

合成标准不确定度：urel（x）= u（x）×x=0.989 ×0.008 231=0.008 140

3.5 扩展不确定度U=K urel（x）=0.81%×2=1.6%（k=2），含量测定结果可表示为：X=（98.9±1.6）%（k=2，置信概率95%）

4 讨论

由表2可以看出，仪器带来的误差是不容忽视的，重复进样的过程中峰面积每针引入的不确定度对最后的结果影响较大。高效液相色谱仪本身对测定结果的影响因素就很多[8]，难以一一评估，在药品分析检测中，应尽量规范化操作，减少不必要的稀释步骤，严格控制实验条件。在称量过程中要严格控制一人操作，避免多人操作带来的人为误差，称量环境的湿度控制也应符合要求。在合成总不确定度中，明显发现对阿奇霉素含量测定准确度的影响比较大的还有标准溶液的配制过程，故在日常工作中可以通过适当加大对照品称样量，选择A级的玻璃容器来减少不确定度对结果的影响，从而更好地控制药物分析的测量结果。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中国药典(二部)[S].北京,2010:153.

[2] 韩永志.化学测量不确定度的估计和表示[J].化工标准计量质量,2001(1):32-34.

[3] 王玉,潘晞陵.药品检测中的片剂重量差异不确定度估算[J].药物分析杂志,2005,25(6):706.

[4] 中华人民共和国药国家技术监督管理局.中华人民共和国国家计量规程·常用玻璃量器(JJG196-2006)[S].北京,2006.

[5] 中华人民共和国药国家质量技术监督局.测量不确定度的评定与表示(JJF1059-2012)[S].北京,2012.

[6] 中国实验室国家认可委员会.实验室认可与管理基础知识[M].北京:中国计量出版社,2003.

[7] 王洪家,马兰,贾志刚.注射用头孢曲松钠含量测定的不确定度分析[J].天津药学,2010,22(1):24-26.

[8] 陆明,范国荣,汪杨,等.测量不确定度在药品检测领域的研究进展[J].中国药事,2013,27(5):485-492.

HPLC method for determination of the uncertainty of azithromycin piece of content analysis

Zhang Zhu

Objective In order to verify the accuracy of the measured values, the uncertainty of HPLC method for determination of azithromycin piece of content analysis.MethodsBy establishing the mathematical model of the HPLC method for determination of content,and according to the measurement uncertainty evaluation and technical specification for said(JJF1059.1-2012)of the relevant provisions of the evaluate the uncertainty.ResultThe analysis of influencing factors of uncertainty,the expanded uncertainty of the measurement results and the confidence interval.ConclusionThe method to estimate the uncertainty of applicable to the tablet class of uncertainty analysis.

Azithromycin;Uncertainty;Content;HPLC

R927.2

A【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.12.005

长春市食品药品检验中心,辽宁长春 130012

张竹（1984-），本科学历，主管药师。研究方向：药物分析。E-mail：qijiouruola@sohu.com