南方野生葡萄酵母菌资源研究进展

陈梦娟，周红丽*，朱韵奕

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

南方野生葡萄酵母菌资源研究进展

陈梦娟1，周红丽2*，朱韵奕1

（1.湖南农业大学 食品科技学院，湖南 长沙 410128；2.食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

在南方野生葡萄人工大面积种植及各地大力发展葡萄酒产业的基础上，该文对南方地区野生葡萄酵母菌种生境的优势、酵母菌资源研究进展及酵母菌资源开发的研究方法进行了综述，发现南方地区的野生葡萄及葡萄酒产业具有独特的发展优势，且酵母菌资源丰富，但目前对其的开发及应用的程度有限，仍有较大的研究空间。为选育出适合酿造南方野生葡萄酒的优质野生酵母菌种、生产出具有地Ⅱ性特色的葡萄酒产品以及为提高品牌的知名度提供了广阔的应用前景。

南方产区；野生葡萄；酵母菌；资源优势

葡萄酒因具有较强的保健功能，且体现出时尚、高雅、尊贵等特点深受人们青睐，并将其用于各种社交场合中。中国的葡萄酒市场长期由国外品牌及合资品牌所占领，虽然近几年中国的葡萄酒产业发展迅猛，葡萄酒的消费量增长趋势显著[1-4]，但由于许多生产商多采用相同的葡萄品种为原料及活性干酵母进行生产，导致市场上的产品间差异性不显著[5]，各品牌特色不突出，消费者的购买Ⅺ逐渐下降，这样的冲击对于起步较晚的中国葡萄酒行业来说是难以抵挡的[6]。

在葡萄酒的酿造中，选用优质葡萄为原料，并筛选应用具有较强发酵性能的酵母菌为发酵剂是酿造特色葡萄酒的关键因素[7-10]。由于葡萄酒产业的发展持续升温，酿制地Ⅱ性特色葡萄酒也成为近几年的研究热点之一[11-13]。南方地区的野生葡萄是宝贵而又独特的植物资源之一，由于其抗病性、加工性及营养价值等方面优于其他多个品种的葡萄[14-16]，是酿造葡萄酒的优质原材料。部分南方的酒庄已采用南方野生葡萄进行酿造，但为了更好地控制整个酿造过程，大多数酒庄仍采用活性干酵母进行纯种发酵。有研究表明，从与葡萄酒酿造的相关环境中分离所得的酿酒酵母更适用于该产区葡萄酒的酿造，所产葡萄酒中风味物质的种类及数量明显高于使用其他活性干酵母酿造的葡萄酒，且使用本土酵母发酵后得到的原酒中杂醇油含量更低[17]。因此，本文综述了南方野生葡萄生境中酵母菌菌种资源的分布规律及酵母菌资源开发的研究方法，以期为酿造出能体现南方野生葡萄独特风味的葡萄酒奠定基础，也为构建南方野生葡萄酵母菌生物多样性信息资源库及菌种资源库提供参考。

1 酵母菌资源的生存优势

不同的生态环境和栽培条件孕育了丰富的优良栽培品种和酵母菌类型。因此从生长环境及葡萄植株上筛选出可以充分展现该葡萄品种个性、地Ⅱ特性的酵母[18]，并帮助酿酒师酿出风格独特、又有品种典型性的葡萄酒已成为普遍关注的课题。

1.1 野生葡萄优越的种植条件

我国南方野生葡萄的种植面积较大且品种较多，产区主要位于秦岭淮河以南的湖南、湖北、广西、福建等多个省市[19]，该产区属于亚热带季风性湿润气候地区，特点是四季分明，夏季高温高湿，冬季温暖湿润，且该地区山地丘陵较多，水系纵横，土壤以红土和黄土为主。产区的海拔为600～1 800 m，年平均气温16～20℃，绝对最高气温41.9℃，绝对最低气温-10℃，10℃以上活动积温5 000～5 800℃，无霜期270～310 d，年降雨量1 200～1 700 mm，丰富的气候资源使南方地区野生葡萄的种类繁多，野生果树资源丰富。以湖南省为例，在凤凰、吉首、怀化、常德等地已有大面积的南方野生葡萄种植基地，并且在近几年已形成如“神州庄园”系列葡萄酒、“湘珍珠”、“桐木红”等系列的刺葡萄酒品牌。

1.2 丰富的野生葡萄品种

葡萄的表皮上有大量的酵母存在，只要果皮破裂，酵母与葡萄汁接触，就会自然发酵酿成葡萄酒。这种自然发酵的葡萄酒魅力在于利用自然附着在葡萄果实上的多种野生酵母进行发酵，可赋㈣葡萄酒特有的地Ⅱ性风味。在南方产区，不同的种植基地因其地理条件、土壤种类及野生葡萄品种等差异，为酵母菌提供了多种不同的生境，造就了南方地区丰富的酵母菌菌种资源。

毛葡萄、刺葡萄和华东葡萄等南方野生葡萄品种在南方地区分布较广且产量较高[20]。湖南省及福建省栽培的野生葡萄以刺葡萄为主，已投入生产性种植的品种有“龙峰”、“紫秋”、“君子”、“连山”、“惠良”等[21-23]，此外这两个省的野生葡萄资源还有华东葡萄，但是仍在人工选育阶段[24-25]。广西省主要栽培的是野生毛葡萄，其中“野酿2号”为两性花毛葡萄，具有产量高、果实大及抗病性良好的特点，并且其种植面积正在逐步增大[26]。

2 南方野生葡萄产区酵母菌资源的研究

近年来有研究表明，不同的产地、气候环境、葡萄品种和年份等对酵母群落的差异有较大影响[27-28]。杨莹等[29]从毛葡萄表面及发酵汁分离出180株酵母，通过分类及26SrDNA序列分析表明，分离所得酵母菌分属于6个属9个种，其中毛葡萄表面的优势酵母菌为汉逊酵母属（Hansenulasp.）的Hansenula guilliermondii，而发酵汁中前期以非酿酒酵母为主，中后期则以酿酒酵母为主，且其比例逐步增大。杨捷[30]对湖南怀化种植的刺葡萄表面及发酵前中后期的发酵料中进行酵母菌分离，共得到126株酵母菌，通过WL培养基进行分类鉴定，得到6个属8个种分别为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、异常汉逊酵母（Hansenula anomala）、中间型酒香酵母（Brettanomyces intermedius）、路氏类酵母（Saccharomycodes ludwigii）、红酵母（Rhodutorulasp.）、膜璞毕赤酵母（Pichiamem branefaciens）及克鲁维毕赤酵母（Pichia kluvveri），并将分离得到的59株酿酒酵母中选育出具有优良发酵性能的野生酿酒酵母。王瑞琛等[31]从原料果实、原酒及发酵完成后的皮渣中分离出酿酒酵母，经过生理生化测试从90株酵母中筛选出一株可专用于刺葡萄酒酿造的酿酒酵母。何志刚等[32]采用分离培养、生理生化鉴定及18SrDNA测序分析，从刺葡萄酒中筛选鉴定出可以降酸的酿酒酵母，并发现对不同的水果酿酒酵母的降酸能力不同。

目前，国内已发现的葡萄酒酵母菌资源约19个属54个种[33]，其中大多数研究报道源自于北方产区，而南方地区的相关报道较少。从已有的南方野生葡萄酵母菌资源的研究报道中不难发现目前的开发程度较低，研究手法也存在很大的局限性，研究所得到的结果可能遗漏了部分酵母菌资源，无法形成较为完整的酵母菌资源信息库，限制了野生酿酒酵母的开发和利用，对南方地区野生葡萄酒产业的发展是不利的。

3 酵母菌资源开发的研究方法

根据已有的研究报道发现，对于酵母菌资源开发的常用研究方法主要是传统分离鉴定及分子生物学鉴定，但有研究表明，这两种方法囊括的微生物信息不完整[34]，因此部分研究人员将近几年才发展起来的高新技术—宏基因组学技术引入菌种资源开发的领Ⅱ，该方法得到的结果更加全面清晰。

3.1 传统分离鉴定

传统分离鉴定法是根据酵母菌的培养上的菌落形态、显微镜下的菌体形态及各项生理生化特性测试结果等进行判断的。然而菌种的分离纯化培养较复杂且工作量大，分离和培养过程中会受到多种因素的限制，不能全面客观地反⒊出微生物的多样性。正因为分离培养方法准确性低，重现性差，结果易遗漏[35]，所以该方法现只用于分离得到单菌落并描述其菌落特征。

近年来，有研究者[36]使用WL培养基检测发酵产品中的酵母菌，通过酵母菌在WL培养基上生长时会呈现出不同的颜色以及形态进行分类鉴定。采用WL培养基可区分出大部分的酵母菌，因此，国内外研究者常将其用作酵母菌鉴定及分类的辅助手段之一[37-38]。但是WL培养基也存在一些缺点：第一，培养时间较长，一般要培养3～5 d才得到试验结果。第二，在WL培养基上酵母菌的菌落形态及颜色相似度较高，只是某些表现型存在差异，因此无法精准判断，在分类鉴定时可能导致判断错误。

3.2 分子生物学鉴定

近年来，基于分子生物学技术和脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）序列分析技术的不断发展和完善，极大限度地弥补了传统分离鉴定的不足，对菌种的开发及选育提供了极大地帮助。在分析食品中微生物多样性时，研究者多以传统分离鉴定与分子生物方法结合使用，提高了分析结果的准确性[39]。徐艳文等[40]从甘肃的两个酒厂样品中分离得到29株酵母菌株，并结合26S rDNA-限制性片段长度多态性（restricted fragment length polymorphisms，RFLP）分析鉴定将菌株分为10个种。LI E等[41]采用商业酵母进行的纯种发酵并对发酵过程中酵母菌的多样性进行研究，根据WLN培养基及26S rDNA D1/D2序列鉴定结果表明，非酿酒酵母主要出现在发酵的早期阶段且种类较为丰富，而酿酒酵母出现在中后期且为整个过程中的优势菌。上述实验表明，传统的分离培养与分子生物学方法相结合后可在较短时间内极大地提高鉴定结果的准确性及重复性。

分子生物学鉴定方法的应用已较为广泛，但是仍存在某些局限性：第一，在聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）过程中常使用“通用引物”，但并不能对所有的微生物DNA都进行有效地扩增，因此之后得到的实验结果可能会导致一些基因信息的丢失；第二，在PCR扩增产物中含有异源双链DNA，可能导致放大微生物多样性的结果；第三，上述方法通过研究不完整的特异片段对微生物群落进行分析，并且丰度较低的微生物容易被遗漏，其分析结果的覆盖程度及准确性较低。这也是用分子生物学技术研究生物多样性的巨大局限[42]。

3.3 宏基因组学技术

宏基因组学（Metagenomics）研究环境中微生物多样性的新方法，即对某一环境中微生物总DNA进行提取，然后通过构建文库，并采用不同的分析、筛选方法来获得微生物多样性信息、新功能基因及活性代谢产物等。近年来，由于高通量测序技术的出现并且不断更新，推动着宏基因组学技术快速地发展。随着测序的速度与精度大幅度地提升及测序费用的不断降低，基于高通量测序的宏基因组学技术已逐步从实验室研究阶段扩展到食品工业生产中[43]，对酵母菌菌种资源的研究、开发和利用带来革命性的改变，同时还可以提高葡萄酒产品的食用安全[44]。STERNES P R等[45]采用宏基因组技术来监测在葡萄酒的自然发酵中5种不同真菌的消长情况，并使用霰弹枪基因组学技术来评估不同发酵阶段的群落结构。BOKULICH N A等[46]从加利福尼亚地区的酿酒厂中提取了235个样品进行研究分析，结果表明真菌谱主要是丝状真菌，枝孢菌属（Cladosporiumspp.）的平均相对丰度达到28.2%，其中有显着的酵母菌群，包括酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）（相对丰度为4.0%），汉逊酵母属（Hansenulaspp.）（相对丰度为5.0%）和假丝酵母（Candidaspp.）（相对丰度为1.3%）。

宏基因组学技术是一个新型的、具有潜力的科学技术，既可从葡萄的生境及发酵过程中开发出具有优良发酵性能的菌种制备成发酵剂，加速有益于发酵过程的物质的合成，亦可采用该技术对整个发酵过程建立起监控模型，对发酵过程进行预测，以确保过程及效率。因此，在葡萄酒生产及酵母菌资源开发研究中引入宏基因组学技术进行辅助研究是极为重要的。

4 结论与展望

酵母菌群是葡萄酒酿造过程中极为重要的菌群，酵母菌群的组成对酿造出独具特色的优质葡萄酒起着决定性的作用[47]。本文从南方地区野生葡萄酵母菌种的生存环境优势、南方野生葡萄产区酵母菌资源研究进展和酵母菌资源开发的研究方法三个方面进行了综述。结果表明，南方地区野生葡萄的酵母菌资源开发程度较低，仅体现在从酿造过程及葡萄果实上分离菌种并进行种类鉴定，存在取样范围较小、研究方法较为落后等问题，并且就目前研究成果来看，也无法构建较完整的菌种资源信息库。因此，今后可以在南方野生葡萄的葡萄果实上、葡萄种植园、酿酒过程中和酒厂的容器内等多个环境中进行酵母菌分离、选育和鉴定，并且将筛选出的酵母菌应用于实际生产实践中，充分开发和利用南方地区丰富的酵母菌菌种资源，同时将研究成果进行汇集整理，以便构建酵母菌资源信息库及丰富其内容。

总之，要将南方产区的酵母菌资源充分开发并利用起来，积极地开展对酵母菌资源及南方野生葡萄酒的研究，开发出具有地Ⅱ性特色的葡萄酒产品，为推动南方野生葡萄及野生葡萄酒产业的发展做出贡献。

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Research progress on yeast resources in wild grape from the South of China

CHEN Mengjuan1,ZHOU Hongli2*,ZHU Yunyi1
（1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China;2.Hunan Key Laboratory of Food Biotechnology,Changsha 410128,China）

On the basis of planting a large area of wild grape in the South of China and vigorously developing the wine industry,the habitat advantage of yeasts from wild grape in the South of China,the research progress of the yeast resources and the research methods of developing the yeast resources were summarized.It found that the wild grape and wine industry in the South of China had unique development advantages,and the yeasts resources were abundant,but its development and application were limited at present,there was still considerable research space.The study provided a broad application prospect for breeding high-quality wild yeast strains suitable for brewing southern wild grape wine,producing wine products with regional characteristics and improving brand awareness.

Southern producing areas;wild grape;yeast;resource advantage

TS264.2

0254-5071（2017）12-0001-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.001

2017-06-19

湖南省教育厅重点项目（14A072）

陈梦娟（1992-），女，硕士研究生，研究方向为食品生物科技。

*通讯作者：周红丽（1972-），女，教授，博士，研究方向为农副产品综合利用研究、发酵食品研究与开发。