钙拮抗剂对大鼠脑缺血后血脑屏障通透性的影响

宋江莉，袁 婕

1.陕西省人民医院神经内一科(西安710068)，2.陕西省富平县医院内二科(富平 711700)



钙拮抗剂对大鼠脑缺血后血脑屏障通透性的影响

宋江莉1,2，袁 婕1

1.陕西省人民医院神经内一科(西安710068)，2.陕西省富平县医院内二科(富平 711700)

目的:探讨钙拮抗剂对大鼠脑缺血后血脑屏障(BBB)通透性的影响。方法:制备脑缺血再灌注(CIR)大鼠模型150只，在大鼠缺血2h后进行再灌注。将大鼠平均分为观察组(尼莫地平)与对照组(生理盐水)，在6、12、24、48、72h时间点分别进行再灌注，观察每个时间点BBB通透性损伤情况及梗死灶体积百分比。结果:随着时间的延长，CIR后BBB通透性与梗死灶体积百分比出现逐步上升，且在12、48h达到双高峰。观察组的BBB通透性及脑梗死灶体积百分比的上升较对照组明显(P<0.05)。结论:CIR能够提升BBB的通透性，增加梗死灶体积百分比，而早期使用钙拮抗剂能够加重上述情况。

细胞内钙离子的过度升高在较多神经性损伤中起到了较为核心的作用[1]。目前的研究表明[2]：钙拮抗剂可以有效中断细胞内钙离子的交换，减轻细胞内钙离子浓度，从而缓解血管痉挛。但是，国内外学者在研究脑缺血再灌注(CIR)时，发现钙拮抗剂在对血脑屏障(BBB)保护方面存在较大的争议[3]。本研究就钙拮抗剂尼莫地平在CIR后对BBB通透性的影响进行了实验性研究，现报告如下。

材料与方法

1 实验材料

1.1 仪器与试剂：尼莫地平注射液、甲酰胺、分光光度计以及电子显微镜等。

1.2 CIR模型制备：选择SD大鼠150只，体重200～250 g。本研究CIR造模采用插线法进行，先给予每只大鼠350mg/kg水合氯醛，腹腔注射进行麻醉。待充分麻醉后暴露颈部，并逐步分离、暴露右侧颈动脉。选择直径0.26mm的鱼线，在手术前放入多聚赖氨溶液中浸泡。手术时先用血管夹夹闭右侧颈动脉，并在动脉上剪一小口，将鱼线一端缓慢送入，直到该端到达大脑中动脉起始部位。然后利用鱼线阻断该动脉，即可引起局部脑缺血。当阻断该动脉2h后将鱼线牵拉回颈内、外动脉的分叉部位，即可实现再灌注。

2 动物分组 根据数字随机分组原则进行实验分组，其中观察组(尼莫地平)75只，对照组(生理盐水)75只。每组大鼠根据再灌注时间的不同再次进行分组，6、12、24、48、72h组各15只。观察组在造模后给予2mg/kg剂量的尼莫地平腹腔注射并在再灌注后每12h再次进行相同剂量尼莫地平腹腔注射。对照组在造模后给予2mg/kg剂量的生理盐水腹腔注射，并在再灌注后每12h再次进行相同剂量生理盐水腹腔注射。每只大鼠在相应时间点进行处死，每组选取6只进行后续实验。

3 BBB通透性检测 每次大鼠在处死前2h，给予1%EB生理盐水溶液静脉注射。大鼠处死后取脑组织，将组织放置于甲酰胺溶液中，剂量按照3ml/10mg脑组织计算。然后进行24h水浴，温度设定为60℃。24h后使用荧光光度计测定光度值，并进行脑组织中EB含量的测定，以EB含量最为BBB通透性检验指标。

4 脑梗死灶体积检测 使用TTC染色法进行，将脑组织先行放入-20℃冰柜中保存，待冰冻后进行冠状切片，厚度2mm左右。然后将切片放入2%TTC溶液中，避光孵育30min，温度设定为37℃。将孵育后的切片用4%多聚甲醛固定，24h后进行拍照，并使用图像分析仪检测每张切片的梗死灶面积，并计算其体积。

结 果

1 CIR后BBB通透性分析 见表1。随着时间的延长，缺血后脑组织中的EB水平亦随着再灌注时间的延长而出现明显的上升，且在12h、48h达到双高峰。两组进行比较，可发现观察组的EB水平与对照组同时间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组大鼠CIR后不同时点EB蛋白含量比较

注：与对照组同时间段比较，*P<0.05

2 CIR后脑梗死灶占全脑体积百分比分析 见表2。随着时间的延长，两组大鼠梗死灶体积均出现了显著的上升，且在12、48h达到双高峰。CIR 24 h后，观察组脑梗死体积明显大于对照组(P<0.05)。

表2 两组大鼠CIR后脑梗死灶占全脑体积百分比±s)

注：与对照组同时间段比较，*P<0.05

讨 论

目前的研究发现[4]：BBB通透性的特异性检测指标以EB较为精准和可靠。EB在血液中能够和血清蛋白进行结合，并形成EB白蛋白。在正常情况下，EB白蛋白是不可以通过BB，进入脑组织的。在BBB受到损伤的情况下，EB白蛋白可以和血液中的其他相关蛋白一同通过组织的间隙，从而进入大脑[5]。实验研究表明[6]：脑组织中EB含量与BBB受损的情况成正相关。因此，对大鼠脑组织中的EB水平进行测定，能够准确、快速得知BBB的受损程度。

本研究发现：无论是观察组还是对照组的大鼠，脑组织中EB水平随着CIR时间的延长出现较大程度的上升。说明脑缺血后，能够引发BBB的损伤，导致其通透性出现上升，因此能够在脑组织中检测到EB的集聚升高。本实验还发现：EB水平在CIR后12h以及48h出现了两个高峰值，提示BBB通透性在CIR后可能存在双期性开放。关于EB水平为何存在双峰现象的研究也较多，Kuroiwa等发现：在EB上升的过程中，脑组织内基质金属蛋白酶(MMPs)，特别是MMP-2de 水平也发生了双峰升高的现象，说明MMPs与EB水平上升存在较大的联系。此外，研究还发现：BBB通透性的变化可能属于一种应激反应，在12hEB上升时，BBB的结构、功能虽然受到一定的破坏，但尚未造成严重的情况。48hEB再度严重上升时，说明此时BBB损伤严重，通透性上升极为明显。

钙拮抗剂目前在临床上广泛用于治疗缺血性神经损伤引发的相关疾病，其能够通过阻止细胞外钙离子进入细胞内，从而达到治疗的目的[7]。但在本实验中，尼莫地平在CIR大鼠中却无法缓解造模后脑组织EB水平以及梗死灶发的体积百分比。相反，与对照组比较，尼莫地平反而加重了大鼠BBB通透性以及梗死灶体积比例。通过相关文献的查阅，造成这种情况的原因可以从以下几个方面阐述[8]：脑缺血后随即使用钙拮抗剂，是能够一定程度上缓解血管痉挛、阻止BBB通透性上升的作用的。但是，钙拮抗剂的使用，也可能损伤血管内血流的自动调控，从而出现BBB通透性的上升。此外，CIR能够引起生物膜发生结构、功能的改变，而钙拮抗剂能够加重这一破坏。因此，在CIR后，随即使用钙拮抗剂时能够对脑组织造成一定程度破坏的。

总之，CIR后BBB通透性是呈现进行性上升的，并且在12h、48h达到双峰值。而再灌注后使用钙拮抗剂，能够加重脑组织EB水平及梗死灶体积，造成BBB通透性进一步上升的关键。因此，再灌注后不应立即给予钙拮抗剂，防止脑组织损伤恶化。

[1] 杨霄鹏,李秋芳,杨瑞玲,等.金纳多对脑缺血再灌注损伤大鼠MMP-9活性和血脑屏障通透性的影响[J].中国老年学杂志,2012,32(10):2105-2107.

[2] 崔冬雪.改善药物血脑屏障通透性方法的研究进展[J].军事医学,2012,36(9):718-720.

[3] 刘 翔，许静红，齐铁伟，等.急性创伤性脑损伤大鼠血脑屏障通透性变化与Claudin-5的相关性研究[J].中华神经医学杂志,2012,11(9):954-957.

[4] 陈应柱,张娴娴,肖 璐,等.丁苯酞对放射性脑损伤大鼠血脑屏障的影响[J].中华放射肿瘤学杂志,2012,21(4):392-395.

[5] 金 路,喻 斌,董小平,等.血脑屏障上的P-糖蛋白及其他ABC超家族转运蛋白的调控[J].中药新药与临床药理,2012,23(4):493-496.

[6] 宋 毅,秦石成,张 勇,等.超声联合微气泡开放大鼠血脑屏障的实验研究[J].中华超声影像学杂志,2012,(7):613-616.

[7] 王振华,刘云会,马 腾,等.大鼠局灶性脑缺血再灌注早期血脑屏障通透性变化的研究[J].中国医科大学学报,2012,41(12):1073-1076.

[8] 李 兵,陈祎招,蒋伟平,等.脑出血后血脑屏障紧密连接蛋白occludin的表达变化[J].中华神经医学杂志,2012,11(6):575-580.

(收稿：2016-05-20)

Effect of calcium antagonist on the permeability of blood brain barrier (BBB) after cerebral ischemia in rats

Song Jiangli,Yuan Jie.

Department of Neurology,Shaanxi Provincial People’s Hospital(Xi’an710068)

Objective: To observe the effect of calcium antagonist on the permeability of blood brain barrier (BBB) after cerebral ischemia in rats. Methods: 150 rat models of cerebral ischemia-reperfusion (CIR) were prepared and the brains of subjects were reperfusion after ischemia in 2h. The rats were divided into observation group (nimodipine) and control group (normal saline), respectively to reperfusion in 6h, 12h, 24h, 48h, 72h time points, to observe the BBB permeability damage and Measurement infarct volume percentage on each time point. Results: with the prolongation of time, the percentage of BBB permeability and infarct volume increased gradually after CIR, and reached the peak in 12h and 48h. The BBB permeability and the percentage of infarct volume in the observation group were significantly higher than those in the control group (P< 0.05). Conclusion: CIR can increase the permeability of BBB, increase the percentage of infarct volume, and the early use of calcium antagonists can aggravate the situation.

Brain ischemia/pathology Calcium channel blockers/therapeutic use Blood-brain barrier @ Nimodipine

脑缺血/病理生理学 钙通道阻滞药/治疗应用 血脑屏障 @尼莫地平

R743.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.01.002