三七治疗局灶性缺血性脑梗死模型小鼠的疗效及机制

王改凤 张社峰 王伟民

(河南省中医院脑病科，河南 郑州 450000)

三七治疗局灶性缺血性脑梗死模型小鼠的疗效及机制

王改凤 张社峰 王伟民

(河南省中医院脑病科，河南 郑州 450000)

目的观察三七对脑梗死模型小鼠的影响，探讨作用机制。方法将50只SD小鼠随机分成正常组、模型组、三七高剂量组、三七低剂量组和西药组。通过线栓法构建小鼠脑梗死模型。成模后，治疗组开始三七溶液灌胃给药12 w。N 组和 CT 组给予等体积的生理盐水溶液。给药结束后观察空腹血糖、肝、肾脏器系数、血清中白细胞介素(IL)-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α以及脑组织中超氧化酶歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等相关指标的含量，并通过实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)检测Bcl-2、Bax mRNA水平。结果三七高剂量组及西药组空腹血糖比模型组有显著下降，而且三七治疗组及西药组均可升高Bcl-2的表达、下调Bax mRNA的表达(P<0.05,P<0.01)。结论三七可能通过升高Bcl-2的表达、下调Bax mRNA的表达，从而减轻局灶性缺血性小鼠脑梗死。

三七；局灶性缺血性脑梗死；Bcl-2

在缺血性脑梗死的病理机制中，炎症氧化应激反应导致的脑损伤作用非常明显〔1，2〕。然而，到目前为止医疗科学界对局灶性缺血脑梗死还没有高效无害的治疗措施。本研究采用局灶性缺血性脑梗死模型小鼠观察三七的疗效及其对Bcl-2及Bax基因表达的影响。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 三七(西安天瑞有限公司);Trizol (生工生物技术有限公司)；Bcl-2及Bax 引物 (生工生物科技有限公司)；血糖试剂盒，南京建成生物工程研究所，白细胞介素(IL)-18、肿瘤坏死因子(TNF)-α 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(欣博盛生物科技有限公司)。酶标仪，北京瑞利分析仪器公司。PCR仪(Thermo赛默飞世尔科技公司,美国)；电子天平，上海精天电子仪器有公司。

1.2实验动物 购自广东省实验动物中心，SPF级C57/BL小鼠50只,体重22～25 g。将小鼠用水合氯醛麻醉后造模:小鼠麻醉后仰卧位固定，由小鼠的颈正中切口，分离左侧颈总动脉及颈外动脉和颈内动脉，随后结扎并分离颈外动脉主干，在颈外动脉游离段上剪开一小口，将预先制备好的尼龙线栓子插入，经颈总动脉分支处通过颈内动脉入颅，至大脑前动脉首端，尼龙线插入深度平均为(18.5±0.5)mm，保持30 min。成模标准：左侧肢体疼痛回缩迟钝或消失；倒悬时左上肢向胸前屈曲；行走时身体向左侧倾倒或向左转圈；右侧出现Honer征。随后将成模小鼠随机分为模型组与三七高、低剂量给药组、西药组各10只。均饲养在SPF级动物房中，自由饮用纯净水。给药方法:三七高、低剂量组中，每只小鼠分别按150、75 mg·kg-1·d-1灌胃三七溶液，西药组给予阿司匹林混悬液15 mg·kg-1·d-1。模型组和正常组均灌服等体积生理盐水,连续10 w。

1.3脑组织含水量测定 用10%水合氯醛麻醉小鼠，固定小鼠头部，去除额极，取病变的脑组织用于脑含水量测定。(1)将脑组织取出后立即称重，即得湿重M1；(2)将脑组织放入95℃烤箱内烘24 h后取出称重，即得干重M2；(3)含水量即(M1-M2)/M1×100%。

1.4血清IL-18、TNF-α水平检测 小鼠禁食12 h，用10%水合氯醛麻醉小鼠后，眼底静脉丛取血后，室温静置30 min,分离血清，按照ELISA试剂盒说明书检测IL-18、TNF-α水平。

1.5脑组织中超氧化酶歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的含量 用10%水合氯醛麻醉小鼠，固定小鼠头部，去除额极，后取病变的脑组织,加入适量PBS匀浆后，按照ELISA试剂盒说明书进行SOD、CAT水平检测。

1.6实时定量聚合酶链反应 将脑组织加入Trizol中匀浆，每1 ml Trizol 加入 0.2 ml三氯甲烷；剧烈混合30 s后， 4℃ 12 000 r/min离心10 min，将水相层液体小心转移至新的离心管中；然后加入 0.5 ml异丙醇，混合均匀，室温静置10 min；随后4℃，12 000 r/min离心10 min，可见少量RNA沉淀；吸弃上清溶液，用75%乙醇洗涤沉淀2次；4℃ 7 500 r/min离心沉淀5 min，弃上清，空气中干燥 RNA 沉淀，用DEPC 水溶解 RNA 沉淀；取2 μl溶解后的RNA，用紫外分光光度法测定RNA纯度及浓度；计算总RNA浓度。将溶解后的RNA按试剂盒说明书进行逆转录及扩增。引物：Bcl-2前向：5'GGGGCTACGAGTGGGATGCTGGAGA3',反向：5'Reverse primer TGCACAGCGGGCATTGGGTTG3';Bax前向：5'Forward primer TGGTTGCCCTCTTCTACTTTGC3'反向：5'Reverse primer CCAGTGTCCAGCCCATGATG3',β-actin反向：5'CTGAACCCTAAGGCCAACCGTGAAA3'反向5'TGAAGCTGTAGCCACGCTCGGTC3'，扩增条件：95℃，2 min；95℃，5 s，60℃，32 s，共40个循环。

1.7统计学处理 采用SPSS10.0软件。多组均数间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。

2 结 果

2.1三七对局灶性缺血性脑梗死小鼠空腹血糖的影响 与正常组(6.8 mmol/L)相比，模型组小鼠空腹血糖(12.3 mmol/L)明显增高(P<0.01)。三七高、低剂量给药组(7.5、8.1 mmol/L)，西药组(5.8 mmol/L)小鼠与模型组比较空腹血糖明显下降,且三七高剂量组及西药组小鼠血糖下降更明显(P<0.01 或P<0.05)。

2.2三七对局灶性缺血性脑梗死小鼠肝、肾脏器系数的影响 与正常组(4.2)相比，模型组小鼠肝脏系数(3.9)有所下降(P<0.05)。三七高、低剂量给药组(3.8、3.8)、西药组(3.9)小鼠与模型组比较无显著差异(P>0.05)，提示三七及阿司匹林对小鼠无肝毒性影响。与正常组(5.5)相比，模型组(5.1)小鼠肾系数无显著差异(P>0.05)，而且通过三七低、高剂量(5.1、5.2)、阿司匹林(4.1)给药后，与模型组比较仍无显著差异(P>0.05)，提示三七及阿司匹林对小鼠无肾毒性影响。

2.3三七对局灶性缺血性脑梗死小鼠脑组织含水量的影响 模型组(0.81)小鼠脑组织中含水量较正常组(0.61)明显增加(P<0.01)，三七高剂量组(0.78)及西药组(0.68)小鼠脑组织含水量显著下降(P<0.05)，但三七低剂量组(0.82)与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。

2.4三七对局灶性缺血性脑梗死小鼠血清IL-1β、TNF-α的影响 模型组血清IL-1β(72)、TNF-α(161)水平较正常组(32、70)明显上升(P<0.01)，高剂量三七及阿司匹林干预后能显著下调积血清IL-1β(50、48)、TNF-α(109、98)水平(P<0.01或P<0.05)，但三七低剂量组(71、151)与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。

2.5三七对局灶性缺血性脑梗死小鼠SOD、CAT的影响 与正常组(2.9)相比，模型组(6.0)小鼠CAT水平上升(P<0.01)。三七高剂量组(4.9)及西药组(5.8)与模型组相比CAT水平下降(P<0.01或P<0.05)，但三七低剂量组(6.1)与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。与正常组(81)相比，模型组(47)小鼠SOD水平下降(P<0.01)。三七高剂量组(59)及西药组(78)与模型组相比，血清中SOD水平上升(P<0.01或P<0.05)，但三七低剂量组(53)与模型组相比无统计学差异(P>0.05)。

2.6三七对局灶性缺血性脑梗死小鼠Bcl-2、Bax mRNA表达水平的调节 模型组脑组织Bcl-2、Bax mRNA表达水平(2.0，1.8)较正常组(0.6，0.5)明显上升(P<0.01)，三七高、低剂量及阿司匹林干预后能显著下调Bcl-2、Bax mRNA表达(0.8，1.4，0.8；0.8，1.2，0.7)，且三七高剂量组下调作用更显著(P<0.01或P<0.05)。

3 讨 论

脑梗死是由于机体血管狭窄或闭塞或者血供应不足而导致局部脑组织的缺血性坏死。大部分学者认为其发病机制主要是存在损伤级联反应，其中主要包括炎症、凋亡、氧化应激等，这些因素相互关联，密不可分，从而形成了一个紧密联系的调控体系，通过内环境一系列活动，导致神经细胞凋亡或者死亡〔3～5〕。在局灶性脑缺血损伤的机制中，炎症反应、氧化应激反应在各项研究中都非常活跃；其中有大量数据表明继发性脑损伤后机体内会释放大量炎性因子，而这些炎症因子正是致使血脑屏障损伤的重要因素〔6〕。

近年有大量研究表明，小鼠体内敲除了Bcl-2后，其神经元氧化蛋白的水平被显著上调，同时会发生各种氧化应激反应〔7～9〕。这些结果表明，Bcl-2缺失会导致细胞发生严重的氧化损伤，使细胞抗氧化能力下降。三七及阿司匹林可以下调局灶性缺血性脑梗死小鼠Bcl-2、Bax mRNA表达。

炎症在缺血后的继发性损伤中发挥很大的作用。因此，减轻病患的炎症损伤是治疗脑缺血的重要手段。单核巨噬细胞被激活后，会分泌产生大量的细胞因子，其中包括TNF-α。有实验表明，TNF-α 被TNF 结合蛋白抑制剂阻断后，实验小鼠的脑梗死体积明显缩小〔10,11〕。IL-1主要由 Th2 细胞分泌，其家族主要包括 IL-1α、IL-1Ra、IL-1β等。目前的研究表明其可能是通过调节相关炎性细胞因子减轻局灶性脑缺血损伤，而且具有明显的抗炎效果，与脑缺血损伤后神经元的修复过程密切相关〔12,13〕。本实验提示三七治疗局灶性缺血性脑梗死小鼠，可能通过抗炎作用，修复小鼠脑缺血损伤后的神经元。

1Hartley A.Trends in mortality from ischemic heart disease and cerebrovascular disease in europe:1980 to 2009〔J〕.Circulation,2016;133(20):1916-26.

2Sui HJ.Prognostic value of diffusion-weighted imaging (DWI)apparent diffusion coefficient (ADC)in patients with hyperacute cerebral infarction receiving rt-PA intravenous thrombolytic therapy〔J〕.Med Sci Monit,2016；22:4438-45.

3Yaghmour W,Kurdi ME,Baeesa SS.De novo glioblastoma in the territory of a recent middle cerebral artery infarction and a residual meningioma:pathogenesis revisited〔J〕.World J Surg Oncol,2016;14:112.

4Yoo BR.Analysis of the outcome and prognostic factors of decompressive craniectomy between young and elderly patients for acute middle cerebral artery infarction〔J〕.J Cerebrovasc Endovasc Neurosurg,2016;18(3):175-84.

5Cuenca-Lopez MD.Inflammation as a therapeutic agent in cerebral infarction:cellular inflammatory response and inflammatory mediators〔J〕.Rev Neurol,2010;50(6):349-59.

6Schroeter M.Dynamic changes of magnetic resonance imaging abnormalities in relation to inflammation and glial responses after photothrombotic cerebral infarction in the rat brain〔J〕.Acta Neuropathol,2001;101(2):114-22.

7张臻年,赵 杨,王敬卿，等. 通脑活络针刺疗法对大鼠急性脑梗死Bcl-2及Caspase-3的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2013；33(5)：646-50.

8Zhang HR.Neuroprotective effects of Bcl-2 overexpression on nerve cells of rats with acute cerebral infarction〔J〕.Genet Mol Res,2015；14(3):7696-703.

9Jiang Y,Lian YJ.Effects of Danhong injection on hemodynamics and the inflammation-related NF-kappaB signaling pathway in patients with acute cerebral infarction〔J〕.Genet Mol Res,2015;14(4):16929-37.

10林久座，缪克强，张海霞，等. 急性脑梗死早期血清TNF-α和IL-6水平的变化及其意义〔J〕.浙江大学学报医学版，2010；39 (4):415-8.

11方美凤,谭 峰,张 炘，等. 化痰通络颗粒对脑梗死患者外周血细胞因子信号转导抑制因子-3及肿瘤坏死因子-α的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2010；30(11)：1142-5.

12章 薇，刘 智，娄必丹.张力平衡针法对脑梗死患者血清IL-1和sICAM-1、sVCAM-1的影响〔J〕. 中国针灸，2005；25(3)：214-6.

13刘俊伟，任冶龙，刘旭玲，等.人参皂苷Rb1对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后脑梗死体积及脑组织和血清IL-1β的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2013；33(12)：1696-700.

河南省中医药科学研究专项课题(2015zy2023)

王改凤(1981-)，女，硕士，主治医师，主要从事中西医结合治疗脑血管病，中枢神经系统变性、感染及锥体外系等疾病的研究。

R743

A

1005-9202(2017)20-4997-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.018

〔2017-01-11修回〕

(编辑 徐 杰)