重症肌无力患者外周血CD4+T细胞功能的变化及相关机制

郭 淼 张晓莺 李燕云

(新疆生产建设兵团医院神经内科，新疆 乌鲁木齐 830002)

重症肌无力患者外周血CD4+T细胞功能的变化及相关机制

郭 淼 张晓莺 李燕云

(新疆生产建设兵团医院神经内科，新疆 乌鲁木齐 830002)

目的探讨重症肌无力(MG)患者外周血CD4+T细胞功能的变化对其机制。方法抽取初治及治疗病情稳定的MG患者及同期入院进行健康体检者各20例的静脉血10 ml。流式细胞术(FCM)测定其外周血白细胞介素(IL)-17+CD4+T细胞、干扰素(IFN)-γ+CD4+T细胞、肿瘤坏死因子(TNF)-α+CD4+T细胞、IL-2+CD4+T细胞和CD4+CD25highCD127-Treg细胞比例。CD4+T细胞与CD4+CD25highCD127-Treg细胞共孵育后，FCM术测定CD4 T细胞分泌IL-17、IFN-γ、TNF-α及IL-2变化情况。结果与对照组及治疗病情稳定的MG患者相比，初治MG患者外周血IL-17+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞、TNF-α+CD4+T细胞、IL-2+CD4+T细胞比例均显著升高(P<0.05)。MG患者与HC外周血CD4+Foxp3+Treg细胞比例比较差异无统计学意义(P>0.05)。对照组外周血CD4+CD25highCD127-Treg细胞可显著抑制CD4 T细胞分泌IL-17、IFN-γ、TNF-α和IL-2，而MG患者外周血CD4+CD25highCD127-Treg细胞抑制CD4+TT细胞分分泌细胞因子的能力显著降低。结论MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg细胞功能的丧失，致使外周血CD4+T细胞细胞因子分泌能力增强，从而导致MG的发生和发展。

重症肌无力；外周血淋巴细胞；调节性T细胞

重症肌无力(MG)是一种器官特异性的自身免疫性疾病，在大多数情况下，MG的发病原因主要是因为体内大量产生针对骨骼肌乙酰胆碱受体(AchR)的高度特异性自身抗体〔1〕。MG自身免疫反应发生的机制目前还不清楚，但胸腺功能异常时(增生、肿瘤)可导致抗AchR的出现〔2〕；同时遗传因素也与MG的发病密切相关〔3〕。本研究旨在探讨MG患者外周血CD4 T细胞功能的变化及其可能机制。

1 材料与方法

1.1分离外周血单个核细胞 收集2015年06月至2016年12月内科住院的初治MG患者及治疗病情稳定的MG患者各20例及同期入院进行健康体检者20例，将5 ml淋巴细胞分离液按1∶1的比例加入5 ml无菌采集的抗凝血中，置于15 ml离心管中，800 r/min离心15 min，吸取白膜层，放置于15 ml离心管(内含10 ml RPMI 1640培养基)，600 r/min离心10 min，用RPMI 1640培养基重悬细胞沉淀物，再次400 r/min离心8 min，最后用含10%胎牛血清(FBS)、200 IU/ml rhIL-2 RPMI 1640培养基重悬细胞沉淀物，台盼蓝染色计数后制备成浓度为2×106个/ml的细胞悬液。

1.2细胞因子检测方法 将外周血单个核细胞置于1 μg/ml CD3抗体及2 μg/ml CD 28抗体包被的48孔板中，置于37℃、5% CO2培养箱培养72 h，加入1 μg/ml离子霉素及100 ng/ml丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)刺激1 h后加入，高尔基体阻断剂，继续培养5 h，收集细胞，首先进行细胞表面分子CD4染色，然后采用0.5 ml细胞膜固定透化液重悬细胞，室温下避光封存30 min，然后加入相应荧光抗体〔细胞介素(Foxp3)、白细胞介素(IL)-17、干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α及IL-2〕，室温避光30 min，0.2 ml 1%多聚甲醛固定液固定后，采用流式细胞仪进行测定。CD4+T细胞与CD4+CD25highCD127-Treg细胞共孵育后细胞因子的检测，将两种细胞按1∶1比例置于1 μg/ml CD3抗体及2 μg/ml CD 28抗体包被的48孔板，余步骤同上。

1.3统计学方法 应用SPSS18.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1MG患者外周血CD4+T细胞细胞因子分泌能力检测 外周血(IL)-17+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞、TNF-α+CD4+T细胞、IL-2+CD4+T细胞比例分别为(0.45±0.13)、(10.37±4.82)、(21.46±6.38)和(16.83±7.03)，初治MG患者分别为(1.38±0.25)、(20.50±3.93)、(33.82±5.92)和(41.58±6.03)，二者相比差异均有统计学意义(t=3.13，12.94，10.27，22.14；均P<0.05)。治疗病情稳定MG患者分别为(0.69±0.19)、(14.36±2.62)、(26.35±4.17)和(29.35±4.42)，与初治MG患者相比差异有统计学意义(t=2.94，9.29，11.17，18.41，均P<0.05)。

2.2MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg细胞比例检测 MG患者外周血CD4+Foxp3+Treg细胞比例为(7.98±1.12)%，对照组为(7.88±1.08)%，差异无统计学意义(t=0.09，P<0.05)。

2.3对照组外周血Treg功能与MG外周血CD4 Treg功能比较 对照组外周血CD4+CD25highCD127-Treg细胞与MG外周血CD4+T细胞共孵育后，IL-17+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+T细胞、TNF-α+CD4+T细胞、IL-2+CD4+T细胞比例分别为(0.93±0.14)、(14.20±14.20)、(14.20±4.72)和(27.85±5.38)，差异有统计学意义(t=2.14，10.89，27.19，31.11；均P<0.05)。

3 讨 论

本研究提示，CD4+T细胞功能的异常可能与MG的发病密切相关。然而，外周血CD4+T细胞细胞因子分泌能力的增强可能是因为CD4+Treg细胞的免疫抑制功能降低所致。目前，Treg细胞在MG发病中的作用已得到肯定〔4～6〕。因此认为可能是在MG患者外周血中Foxp3+CD4+Treg细胞失去了抑制CD4+T细胞的能力，致使CD4+T细胞分泌大量的炎性因子，最终导致MG的发生。

本研究发现，MG患者外周血CD4+CD25highCD127-Treg细胞功能的丧失，致使外周血CD4+T细胞比例升高，分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α的能力增强，导致炎症扩张，在重症肌无力的发生过程中起到重要作用。

1Meriggioli MN,Sanders DB.Autoimmune myasthenia gravis:emerging clinical and biological heterogeneity〔J〕.Lancet Neurol,2009;8(5):475-90.

2Roxanis I,Micklem K,Willcox N.True epithelial hyperplasia in the thymus of early-onset myasthenia gravis-patients:implications for immunopathogenesis〔J〕.J Neuroimmunol,2001;112(1-2):163-73.

3Landoure G,Knight MA,Stanescu H,etal.A candidate gene for autoimmune myasthenia gravis〔J〕.Neurology,2012;79(4):342-7.

4Thiruppathi M,Rowin J,Li Jiang Q,etal.Functional defect in regulatory T cells in myasthenia gravis〔J〕.Ann N Y Acad Sci,2012;1274:68-76.

5Zhang Y,Wang HB,Chi LJ,etal.The role of FoxP3+CD4+CD25hi Tregs in the pathogenesis of myasthenia gravis〔J〕.Immunol Lett,2009;122(1):52-7.

6Sakuma H,Katayama A,Saito Y,etal.CD4+ CD25(high)regulatory T cell in childhood ocular myasthenia gravis〔J〕.Brain Dev,2011;33(5):442-4.

李燕云(1975-)，女，硕士，副主任医师，主要从事神经内科研究。

郭 淼(1979-)，男，主治医师，主要从事眩晕的诊治研究。

R746.1

A

1005-9202(2017)20-5011-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.20.024

〔2017-05-09修回〕

(编辑 袁左鸣)