老年急性白血病患者死亡相关蛋白激酶基因表达的初步观察

牛一蒙 王亚柱 李艳

老年急性白血病患者死亡相关蛋白激酶基因表达的初步观察

牛一蒙 王亚柱 李艳

白血病在老年人中的发病率较高,且老年人常常合并各种基础疾病,各脏器功能退化,故预后相对较差,死亡率高。探寻老年白血病患者特异性的分子生物学异常,成为目前的研究热点之一[1]。死亡相关蛋白激酶(DAPK)是一种由钙离子、钙调蛋白调节的丝氨酸、苏氨酸激酶,是细胞凋亡的一种正性的调节因子[2-3]。动物实验表明,DAPK能够在肿瘤发育的早期阶段抑制细胞的转化,对于晚期转移也有一定的效果,被认为是肿瘤的抑制剂。DAPK基因表达出现低表达或者缺失,可导致该基因CpG岛的启动子区异常甲基化,失去细胞凋亡作用,被认为是肿瘤发生发展的促进因素[4-5]。

目前国内对于DAPK基因表达在造血系统恶性肿瘤的相关研究,主要集中于全年龄段病人领域。对老年患者的相关研究,国内尚未有相关报道,本研究探讨中国老年急性白血病患者中DAPK基因表达状态,力争为进一步揭示该基因表达在老年急性白血病临床诊疗上的意义,为疾病的早期诊断及判断预后找到新的思路与方法。

1 资料和方法

1.1 临床资料 急性白血病初发老年患者52例,年龄62～81岁，平均(68.52±3.28)岁,均来源于2011年1月到2014年9月本院门诊及病房住院患者,其中急性淋巴细胞白血病(ALL)21例,急性髓细胞性白血病(AML)31例。所有患者年龄≥60岁,均参照《血液病诊断及疗效标准》[6]第3版进行诊断,排除实体肿瘤继发及骨髓异常增生综合征(MDS)转归急性白血病患者。选取血象正常的非白血病老年患者10例为正常对照,年龄61～77岁,平均(67.71±5.94)岁。

1.2 方法

1.2.1 试剂:Ficoll-Hypaque液购自北京鼎国生物公司。氰醌(hydroquinone)亚硫酸氢钠(sodiumbisulfite)购自sigma公司。Wizard DNA Clean-Up System试剂盒购自promega公司。蛋白酶K、dNTP混合液、Taq酶、marker(DL20OO)、TRIzol、逆转录酶M-MLV等购自大连宝生物(TAKARA)公司。GeneFinder购自厦门百维信生物科技有限公司。实验所需引物均由上海生物工程公司合成。

1.2.2 单个核细胞分离:抽取骨髓或外周血5～10 ml,肝素抗凝,经淋巴细胞Ficoll-Hypaque液分离单个细胞。

1.2.3 RNA提取及RT-PCR检测DAPK mRNA表达:TRizol法提取RNA,溶解后采用紫外分光光度仪检测RNA纯度和浓度。cDNA第一链合成体系为25 μl,用逆转录酶M-MLV,OligodT以及相关试剂按说明配成适当浓度,合成cDNA。以Primer软件设计引物,DAPK引物序列上游引物：5′-GCCTGGAGACGGAGAAGAT-3′下游引物5′-AACTCCCGTGGCTGGTAGA-3′，引物长度均为170 bp。β-actin上游引物:5′-GTGCGTGACATTAAGGAG-3′,β-actin下游引物:5′-CTAAGTCATAGTCCGCCT-3′，长度均为520 bp。采用RT-PCR法扩增预处理后的RNA模本,反应条件为95 ℃预变性5 min,然后95 ℃延伸45 s,退火温度为54 ℃ 45 s,延伸温度为72 ℃ 45 s,扩增28个循环,72 ℃延伸5 min。扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶仪上进行电泳1 h,GeneFinder染料染色,成像仪观察并摄像。

1.3 统计学处理 应用SPSS 15.0软件进行统计学分析处理,率和构成比的比较采用卡方检验。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

RT-PCR检测结果表明,DAPK基因在10例正常对照者骨髓标本中均有表达,DAPK mRNA相对含量的表达平均值为0.92±0.18,而在老年急性白血病患者骨髓标本中可见DAPK基因表达缺失及表达水平降低,缺失率达48%(25/52),mRNA表达平均值为0.51±0.20,明显低于正常对照者,差异有统计学意义(P<0.05)。其中52.38%(11/21)的ALL病人骨髓标本DAPK mRNA表达缺失,阳性标本表达平均值为0.53±0.20,AML病人缺失率为45.16%(14/31),表达平均值为0.45±0.21,FAB分型各亚型间缺失率差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 DAPK基因表达情况

3 讨论

DAPK位于人类第9染色体的长臂q34.1,全长4293 bp。可使其底物蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基磷酸化,是一类新发现的钙离子/钙调素依赖激酶[7]。DAPK是一个细胞凋亡正调节子,能以P19ARF依赖的方式激活p53,抑制胚胎成纤维细胞的瘤性转化,激活caspase和导致DNA碎裂而引起细胞凋亡。为多种凋亡信号的汇合点,其表观遗传学如甲基化可促进其表达的缺失[8],从而抑制其促肿瘤细胞凋亡的功能。人类在多种癌症如膀胱癌、肾癌、前列腺癌、肺癌及MDS,B细胞淋巴瘤等血液系统肿瘤中,均发现DAPK基因表达出现低表达或者缺失[9-11]。提示其与癌症的发生发展有着密切的联系。

本研究发现,DAPK基因在10例正常对照者骨髓标本中均有表达,DAPK mRNA相对含量为0.92±0.18,而在老年急性白血病病人骨髓标本中mRNA表达平均值为0.51±0.20,明显低于正常对照者,差异有统计学意义(P<0.05)。其中48%(25/52)的老年急性白血病患者骨髓标本DAPK mRNA表达缺失,该结果提示DAPK基因表达发生改变是老年急性白血病的常见现象。FAB分型各亚型之间比较则无明显差异。之前文献报道,DAPK mRNA 全人群ALL组和AML组的表达缺失率分别是52.7%和38.9%[12],本研究提示AML组老年人群缺失率较非老年人群有所上升,考虑可能与老年患者病程长,疾病进展迅速相关,尚待进一步研究证实。

老年急性白血病患者往往提示着不良的预后[13],本研究的结果为老年急性白血病的早期诊断与治疗提供了新的科研方向,因时间及试验条件限制,尚需大样本试验来进一步验证,同时,逆转该基因表达缺失,是否可改善患者预后,尚需要对患者进一步的随访与观察。

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100001辽宁省沈阳市，中国医科大学附属第一医院干诊科(牛一蒙)；血液科(王亚柱，李艳)

李艳，Email: liyan2@medmail.com.cn

R 733.7

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10.3969/j.issn.1003-9198.2016.12.023

2016-01-04)