HPLC同步测定多种合成色素含量检测结果的不确定度评定

伍雅婷，郭怡阳，黄常刚，刘俊玲，吴晓旻，孙言凤，李静娜

(1武汉市疾病预防控制中心，武汉 430015; 2武汉市妇女儿童医疗保健中心，武汉 430015)

HPLC同步测定多种合成色素含量检测结果的不确定度评定

伍雅婷1，郭怡阳2，黄常刚1，刘俊玲1，吴晓旻1，孙言凤1，李静娜1

(1武汉市疾病预防控制中心，武汉 430015;2武汉市妇女儿童医疗保健中心，武汉 430015)

目的：分析高效液相色谱法(HPLC)同步测定多种色素含量的不确定度。方法：通过评定各不确定度分量，计算合成标准不确定度及扩展不确定度。结果：HPLC同步测定多种色素含量的扩展不确定度范围在3.97%～7.13% (k=2)；天平称量和提取回收率对合成色素的测量结果不确定度影响最大。结论：本研究建立了简便易行的HPLC同步测定肉制品中色素含量检测结果的不确定度评定方法。

高效液相色谱；同步测定；合成色素；不确定度

食品中人工合成色素是食品安全重要的检测指标[1]。肉类通常被认为是基质复杂食品样品的代表，当需要界定肉类及其制品中是否存在合成色素滥用现象时，目前的检测方法通常是对其中可能滥用的色素逐一筛查，这无疑增加了工作量、延长工作时间和降低工作效率，显然更不能对突发事件做出快速反应。本课题组前期开发的色素同步测定方法则可以极大限度地提高基层食品检测单位的效率[2]。不确定度是对测量结果可能误差的度量，也是定量说明测量结果质量好坏的一个参数[3-5]。不确定度的分析是保证检测结果可信度和准确性的关键要素[7-9]。对高效液相色谱法同步测定多种色素含量的不确定度进行分析便于测量者和管理者对测量结果的可信度和准确性进行评定。

本文依据《化学分析中的不确定度的评估指南》[3]、《测量不确定度评定与表示》[8]，对高效液相色谱法同步测定多种色素的含量分析其不确定度进行[2]，对建立的HPLC多种色素测定方法的不确定度进行评价，评价了影响其测定结果的不确定度来源，确保检测过程和结果的可靠性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Waters e2695型高效液相色谱仪、Waters 2998型二极管阵列检测器、Waters717型自动进样器，美国 Waters公司；BP211D电子天平、PT-310电子天平，德国赛多利斯公司；KH-600E超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；AFX2-1001-P超纯水机，颐洋企业发展有限公司；TGL-16M高速冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；BF-S2500无油真空泵，北京八方试剂科技有限公司；Symmetry-C18色谱柱(5μm，4.6×250 mm)，美国Waters公司；固相萃取装置，美国Agilent公司；WAX 6CC固相萃取小柱(150 mg，30 μm)，美国 Waters公司；OA-SYS N-EVAP 112氮吹仪，美国Organomation Associates，Inc.公司。

标准品：柠檬黄(0.500 mg/mL )，中国计量科学研究院；苋菜红(0.500 mg/mL )，中国计量科学研究院；胭脂红(0.500 mg/mL )，中国计量科学研究院；日落黄(0.500 mg/mL)，中国计量科学研究院；亮蓝(0.500 mg/mL)，中国计量科学研究院；新红(92.0%)、诱惑红(83.0%)、红色2G(60.0%)、酸性红(99.0%)、赤藓红(91.7%)、酸性橙Ⅱ(87.0%)，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.2 检测方法

参见本课题组前期发表的文章《同时测定肉制品中酸性橙Ⅱ等11种合成色素的方法研究》[8]。取食品样品可食部捣碎并混合均匀后，准确称取2.00 g置于50 mL离心管，加入2.0 g海砂混匀，加入10 mL石油醚脱脂(样品不含脂肪则无需脱脂)，振摇并超声10 min后(注意放气)，离心10 min(4 000 r/min)，弃去醚层，必要时重复上述过程以保证脱去样品脂肪完全。80℃水浴挥去多余石油醚后，加入20 mL乙醇氨水水溶液，振摇1 min、超声30 min以提取色素，高速冷冻离心 10 min(4℃，10 000 r/min)后立即将溶液转入100 mL烧杯，残渣重复提取2次，每次加入10 mL乙醇氨水水溶液，合并提取液后于80℃水浴蒸发至总体积约 10 mL，用乙酸溶液调至弱酸性(pH=5.0～6.0)，加入5 mL乙腈、5 mL水为试样溶液，待净化。

净化：将试样溶液转移至预先经5 mL甲醇、5 mL水活化的WAX固相萃取小柱，依次用乙腈、酸性甲醇、甲醇和水洗涤2次(5 mL/次)，抽滤至近干后，用 12 mL乙醇氨水水溶液洗脱(流速< 1 mL/min)。洗脱液于40℃下氮气吹至0.5～1 mL，用乙酸溶液调至中性，加入200 μL甲醇并用水定容至5 mL，经0.45 μm聚四氟乙烯有机滤膜过滤后供HPLC-PDA测定。

1.3 样品来源

向已购买的市售肉制品(2g)中加入100μL不同浓度的标准合成色素，充分涡旋震荡5min，超声5min混匀后作为样品。

2 结果与分析

2.1 建立数学模型

试样中色素的含量公式如式(1)：

(1)

式(1)中，X：试样中目标物含量(ng/g)；C：样液测定含量(ng/mL)；V：试样稀释后的总体积(mL)；m：试样的质量(g)；Rec：样品处理后回收率(%)。因此，样品中色素含量的相对标准不确定度的公式为式(2)：

(2)

2.2 分析不确定分量

根据实际前处理方法，不确定度来源主要有重复性操作、容量瓶、移液管、天平称量、标准溶液配置、标准曲线拟合等因素。

2.3 不确定度分量的评定

柠檬黄重复测定引入的相对标准不确定度为：

同理可以计算出新红、胭脂红、苋菜红、日落黄、诱惑红、赤藓红、红色2G、亮蓝、酸性红、酸性橙Ⅱ等色素的相对标准不确定度(表1)。

表1 11种色素重复测量的相对标准不确定度分量

平行测定多种色素的混合标准液3次，则共15次。

表2 曲线方程及标准曲线引入的不确定度

表3 稀释中由玻璃量具校准所致的不确定度

表4 稀释中由温度变化引起的不确定度

而由样品不均匀性引起的测量不确定度用B类评定，因为样品均为液态，并充分涡旋混合，由此带来的不确定度可忽略不计。因此由玻璃量具校准引起的相对标准不确定度为：

稀释过程中由温度产生的相对不确定度为：

试样稀释引入相对标准不确定度为：

同理，各类色素回收率引入的相对标准不确定度结果见表5。

2.4 不确定度的合成

表5 色素加标回收率及相对标准不确定度

表6 样品中各类色素含量测定的不确定度分量

3 讨论

游靖[10]报道了使用国标方法分别检测葡萄酒中的柠檬黄、苋菜红、胭脂红及日落黄的不确定度，其不确定度在为4.08%～4.43%，影响最大的不确定度分量是样品分析中回收率所产生的不确定度。与该研究相比较，由于本实验采用的是百分之一的天平，而使得天平称量所导致的不确定度达1.44%，其不确定度分量对整个实验的不确定度影响最大；同时对酸性红、赤藓红而言，提取回收率的相对标准不确定度分量最大与游靖研究结果一致(表7)。

表7 样品中各类色素含量测定的合成标准不确定度 及扩展不确定度 单位：%

本文对前期所建立的HPLC多色素测定方法的不确定度进行评价，评估了前期开发的肉质品中多种合成色素含量的检测过程中产生的不确定度分量，并计算出其相对扩展不确定度。比较各分量的相对不确定度发现，对大部分色素而言，天平称量所导致的不确定度对整个实验的相对标准不确定度贡献最大；而对酸性红、赤藓红而言，提取回收率的相对标准不确定度分量最大。因此，在试验过程中，除了需要更换精密度更高的天平以外，对样品的处理过程，对标准溶液系列配制过程也需要严格要求。◇

[1]Minioti K S，et al. Determination of 13 synthetic food colorants in water-soluble foods by reversed-phase high-performance liquid chromatography coupled with diode-array detector[J]. Analytica Chimica Acta，2007，583(1)：103-110.

[2]李静娜，等. 同时测定肉制品中酸性橙Ⅱ等11种合成色素的方法研究[J]. 中国食品卫生杂志，2014，26(4)：372-376.

[3]中国合格评定国家认可委员会. 化学分析中不确定度的评估指南[M]. 北京：中国标准出版社，2006.

[4]盖丽娟.氨基酸分析仪测定玉米浆中17种游离氨基酸的不确定度评定[J]. 食品工业科技，2014，35(7)：303-307.

[5]肖静，等. 高效液相色谱法测定鸡肉中恩诺沙星和环丙沙星残留的不确定度分析[J]. 食品工业科技，2012，33(18)：75-78.

[6]陈然. 原子吸收测定饮用水中铜的不确定度评定[J]. 公共卫生与预防医学，2006，17(3)：71-72.

[7]王娣，等. 分光光度法测定酸奶中L(-)-羟脯氨酸含量的不确定度评定[J]. 食品工业科技，2013，34(12)：76-80.

[8]国家质量技术监督局.测量不确定度评定与表示指南[S]. 北京：中国标准出版社，2012.

[9]李静娜，等. 高效液相色谱法测定玉米粉中黄曲霉毒素B1含量的不确定度评定[J]. 公共卫生与预防医学，2015，26(3)：22-25.

[10]游靖，张冰若. 高效液相色谱法测定葡萄酒中合成色素不确定度分析[J]. 现代仪器与医疗，2013，19(6)：59-65.

(责任编辑 李婷婷)

Uncertainty Evaluation on Measurement Results for Simultaneous Determination on Synthetic Pigments by HPLC

WU Ya-ting1,GUO Yi-yang2，HUANG Chang-gang1，LIU Jun-ling1，WU Xiao-min1，SUN Yan-feng1，LI Jing-na1

(1Wuhan Center for Disease Control and Prevention，Wuhan 430015，China;2Wuhan Women and Children’s Health Care Center, Wuhan 430015,China)

【Objective】To evaluate the uncertainty of the content of several kinds of synthetic pigments for simultaneous determination by high performance liquid chromatography (HPLC).【Method】The synthetic standard uncertainties and expanded uncertainties were calculated.【Result】It was found that sample weighing and the rate of recovery had the strongest impact on the uncertainty.The uncertainties of synthetic pigments were at the range of 3.97%～7.13 % (k=2).【Conclusion】A feasible method for uncertainty evaluation on the determination on synthetic pigments in processed meat was established.

HPLC；simultaneous determination；synthetic pigments；uncertainty

武汉市卫生局资助课题(项目编号：WG11B02)。

伍雅婷(1986— )，女，博士，医师，研究方向：公共卫生。

李静娜(1965— )，女，学士，副主任技师，研究方向：食品安全。