肿瘤相关巨噬细胞在食管鳞癌中的临床病理特征分析

冯 稳，于庆凯，陈奎生，孙淼淼△,张建波

(1.郑州大学附属肿瘤医院病理科,郑州 450003；2.郑州大学第一附属医院病理科,郑州 450052)

肿瘤相关巨噬细胞在食管鳞癌中的临床病理特征分析

目的 通过检测肿瘤相关巨噬细胞(TAM)在食管鳞癌组织中的表达，研究TAM浸润在食管鳞癌中的临床病理特征。方法 以郑州大学附属肿瘤医院胸外科接受手术治疗的食管癌患者为研究对象，分别收集每位患者手术切除的食管组织标本，其中包括90份鳞癌组织标本，20份癌旁组织标本，20份正常食管组织标本。以免疫组化法分别检测CD206及单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)在各组织标本中的表达，对比分析检测结果。结果 CD206在食管鳞癌组织中的表达显著升高(P<0.01)，CD206的阳性表达与食管鳞癌组织的临床分期、浸润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。MCP-1在食管鳞癌组织中的阳性表达显著升高(P<0.05)，与食管鳞癌组织的润深度和淋巴结转移密切相关(P<0.05)。TAM浸润数量与MCP-1的表达呈正相关(r=0.617，P<0.05)。结论 通过免疫组化检测TAM在食管鳞癌组织中的表达，揭示了TAM在食管鳞癌中的临床病理特征，对准确评估食管鳞癌患者的临床预后及指导临床治疗具有重要的理论和实践价值。

肿瘤相关巨噬细胞；食管肿瘤；癌，鳞状细胞；淋巴转移

食管癌是全球常见的消化道肿瘤，我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人。在组织学上分为鳞癌、腺癌、小细胞癌、腺棘皮癌等类型，其中以鳞癌为主，占95%以上[1]。近年来通过对肿瘤微环境的研究发现，免疫细胞及其分泌的细胞因子可促进肿瘤的发生、发展、侵袭和转移、血管生成等，构成肿瘤微环境的免疫细胞种类繁多，发挥不同的作用，其中数量最多的当属肿瘤相关巨噬细胞(TAM)[2]，因其表面特异性表达CD206，可以通过检测CD206来间接评估TAM在肿瘤组织中的浸润数量[3-4]。单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)对单核细胞具有趋化活性，激活单核细胞和巨噬细胞，促进TAM的局部浸润[5-6]，而活化的巨噬细胞可抑制肿瘤细胞的生长。本研究拟通过检测CD206、MCP-1在食管鳞癌组织中的表达，阐述TAM浸润在食管鳞癌组织中的临床病理特征，同时研究TAM在食管癌的分期、浸润深度和淋巴结转移中的临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 以2014年1月至2015年11月在郑州大学附属肿瘤医院胸外科接受手术治疗的食管癌患者为研究对象，临床资料完整，其中男50例，女40例，平均年龄(60.0±18.43)岁。分别取患者的食管癌组织标本，经病理学检查全部确诊为食管鳞癌，其中30例呈高分化，33例呈中分化，27例呈低分化；35例侵及黏膜下层，55例侵及肌层或食管外膜；38例有淋巴结转移，52例无淋巴结转移；Ⅰ～Ⅱ期74例，Ⅲ～Ⅳ期16例(患者出现吞咽、呼吸困难，需手术缓解局部压迫症状)。食管癌旁组织20份，分别取自距离患者癌床组织边缘3 cm以内且经病理诊断为不典型增生。食管正常组织20份，分别取自患者手术的切缘部分，距离癌床组织边缘3 cm以外且病理诊断为正常食管组织。组织标本均以10%的多聚甲醛进行固定，石蜡包埋，连续切片(厚度4 μm)备用。

1.2 方法

1.2.1 取材和病理切片的制备 手术切除患者食管癌组织后立即以生理盐水清洗干净，急送病理科，分别留取每位手术患者的癌组织、癌旁组织、正常组织标本各一块，以10%中性福尔马林溶液固定24 h以上，制备石蜡包块，制作连续切片(厚度4 μm，德国Leica切片机)，分别以CD206、MCP-1免疫组化染色，显微镜下观察。

1.2.2 免疫组化 石蜡常规包埋，组织切片的厚度为4 μm，将其放置于载玻片上，二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水，经抗原修复后以10%的山羊血清做封闭，加一抗(鼠抗人CD206单克隆抗体1∶100；兔抗人MCP-1多克隆抗体1∶50，购自美国Abcam公司)置于湿盒内孵育过夜。滴加二抗，湿盒内保存，室温下20 min；用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次；滴加DAB显色液，以中性树胶封片，自然风干24 h。显微镜(Olympus，BX43，日本)下观察组织切片并采集图像。

1.2.3 结果判定

1.2.3.1 TAM计数 参考文献[7-8]的方法，CD206阳性表达位于细胞质，呈棕黄色颗粒，阳性细胞即TAM。在普通光镜下观察组织切片，先在低倍镜(×100)下找到TAM的密集区域，然后切换至高倍物镜(×400)观察，在TAM富集区域随机选取5个视野，分别计数各个视野下阳性细胞的数量，取平均值。

1.2.3.2 MCP-1结果判定 MCP-1阳性表达于细胞质，呈棕黄色颗粒。普通光镜下观察组织病理切片，先在低倍镜(×100)下找到MCP-1的密集区域，然后切换至高倍物镜(×400)观察，随机选取5个视野，分别计数阳性细胞数，取其平均数，根据MCP-1阳性细胞所占百分比和MCP-1阳性染色的深浅对切片观察结果进行判定[7]。评分标准：按阳性细胞数百分比计分：0分(<1%)，1分(1%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(≥76%)；按阳性细胞染色深浅计分：0分(无染色)，1分(淡黄色)，2分(棕黄色)，3分(棕褐色)。总判定标准为阳性细胞所在百分比得分与染色强度得分之和，0～3分为低表达，4～6分为高表达。

2 结 果

2.1 各食管组织中TAM计数 食管鳞癌及癌旁组织中富含CD206阳性细胞，即TAM在食管鳞癌组织中的浸润数量(28.58±8.63)个/HP较癌旁组织(12.43±4.02)个/HP、正常食管组织(4.36±2.45)个/HP多，见图1。

A:正常食管组织；B：癌旁组织；C：食管鳞癌组织。

图1 免疫组化检测各食管组织中CD206的表达(×100)

2.2 食管鳞癌组织中TAM的浸润数量与患者临床资料的关系TAM在食管癌组织的浸润数量与食管鳞癌患者性别、年龄、肿瘤分化程度和肿瘤大小)之间无相关性(P>0.05)，与临床分期、浸润深度和淋巴结转移有相关性(P<0.05)。见表1。

表1 食管鳞癌组织中TAM数量与患者一般临床资料的关系

续表1 食管鳞癌组织中TAM数量与患者一般床资料的关系

2.3 各食管组织中MCP-1的表达情况 食管鳞癌组织和癌旁组织中MCP-1的表达(78%、55%)明显高于正常食管组织(10%)，食管鳞癌组织中MCP-1表达明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.4 食管鳞癌组织中MCP-1表达与肿瘤浸润深度及淋巴结转移的关系 食管鳞癌组织中MCP-1的表达与食管鳞癌的浸润深度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)，见表2。

2.5 食管鳞癌组织中TAM浸润数量与MCP-1表达的关系 食管鳞癌组织中TAM的浸润数量与MCP-1的表达呈正相关(r=0.617，P<0.05)。

A:正常食管组织；B：癌旁组织；C：食管鳞癌组织。

图2 免疫组化检测各食管组织中MCP-1的表达(×100)

3 讨 论

巨噬细胞是来源于骨髓的单核细胞，参与机体的固有和适应性细胞免疫反应，是机体重要的免疫细胞之一。TAM在肿瘤组织中广泛浸润，参与组成肿瘤的微环境，与其他免疫细胞一起调控肿瘤细胞的发生、发展、侵袭等生物学功能。研究发现在肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、直肠癌等肿瘤组织中TAM的浸润数量与患者的生存期密切相关，可以作为评估肿瘤进展、复发、转移的重要预测因子之一[9-13]。

本研究结果发现，在正常食管组织中不表达TAM，而在食管鳞癌组织中TAM的表达显著上调，其浸润数量较癌旁组织和正常食管组织显著增多，与程明国等[14]一致。本研究结果显示，在食管鳞癌组织中TAM的浸润数量与患者的性别、年龄、肿瘤的分化程度和大小无相关性，而与临床分期、浸润深度、淋巴结转移有相关性，提示TAM在食管鳞癌的发生、浸润方面可能发挥一定的生物学作用。

食管肿瘤的全身转移主要是通过血液、淋巴、消化道等途径，其中以淋巴转移较早，也较为重要，实现这一途径的前提条件是淋巴管的生成。MCP-1增加TAM的浸润从而促进肿瘤血管和淋巴管的生成，MCP-1的阳性表达越多，恶性肿瘤的进展越快，癌间质的炎性细胞浸润的也越多，肿瘤越容易发生转移[6]。本研究结果提示，MCP-1的表达在正常食管组织中极低，但在食管鳞癌及其癌旁组织中均显著升高，进一步研究结果提示，MCP-1的表达与食管鳞癌的浸润深度和淋巴转移关系密切，证实了MCP-1参与恶性肿瘤中淋巴管的生成过程。

综上所述，本研究通过免疫组化检测TAM在食管鳞癌组织中的表达，揭示了TAM在食管鳞癌中的临床病理特征。在食管癌的临床病理过程中，TAM的浸润数量与其临床分期、浸润深度和淋巴转移有一定的相关性，本研究结果对准确评估食管鳞癌患者的临床预后及指导临床治疗具有重要的理论和实践价值。

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The clinical pathological characteristics of tumor-associated macrophages in esophageal squamous cell carcinoma*

FengWen1,YuQingkai1,ChenKuisheng2,SunMiaomiao1△,ZhangJianbo1

(1.DepartmentofPathology,theAffiliatedCancerHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450003,China; 2.DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450052,China)

Objective To detect the expression of tumor-associated macrophages(TAM) in esophageal squamous cell carcinoma,and to study the clinical pathological characteristics of TAM in the esophageal squamous cell carcinoma.Methods Patients with esophageal squamous cell carcinoma who accepted operation were chosen as study subjects,and tissue samples of esophagus were collected,including 90 squamous cell carcinoma tissues,20 paracancerous atypical hyperplasia and 20 normal mucosa tissues,and the expression of CD206,MCP-1 were detected by immunohistochemisty.Results The positive expression of CD206 was significantly increased in tissues of esophageal squamous cell carcinoma(P<0.01),and it was positively correlated with clinical stage,invasion depth and lymph node metastasis in esophageal squamous cell carcinoma(P<0.05).The expression of MCP-1 was significantly increased in esophageal squamous carcinoma tissues(P<0.05),and its positive expression was closely correlated with depth of invasion and lymph node metastasis in esophageal squamous cell carcinoma(P<0.05).There was a positive relation between ATM infiltration quantity and the expression of MCP-1(r=0.617,P<0.05).Conclusion The positive expression of TAM was up-regulated in esophageal squamous cell carcinoma tissues,and its number was positively correlated with clinical stage,invasion depth and lymph node metastasis.

tumor-associated macrophages;esophageal neoplasms;carcinoma,squamous cell;lymphatic metastasis

��·临床研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.36.012

2013年河南省重点科技攻关计划项目(132102310086)。 作者简介：冯稳(1979-)，主治医师，本科，主要从事消化系统肿瘤研究。△

冯 稳1，于庆凯1，陈奎生2，孙淼淼1△,张建波1

(1.郑州大学附属肿瘤医院病理科,郑州 450003；2.郑州大学第一附属医院病理科,郑州 450052)

R602

A

1671-8348(2016)36-5078-03

2016-07-16

2016-08-25)