猪乙型脑炎病毒实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，莫 玲，李 峰，沈志强

（滨州市畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪乙型脑炎病毒实验室检测方法研究进展

庄金秋，梅建国，张 颖，莫 玲，李 峰，沈志强

（滨州市畜牧兽医研究院，山东滨州 256600）

猪乙型脑炎严重危害着人类健康，给世界养猪业造成了极大经济损失。本文从血清学和病原学方面入手，综述了猪乙型脑炎病毒最新实验室检测方法研究进展，以期为该病的预防与控制提供参考。

猪乙型脑炎；日本脑炎病毒；检测方法；研究进展

猪乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）又称流行性乙型脑炎、日本乙型脑炎，简称乙脑，是由黄病毒科黄病毒属的日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一种严重的蚊媒性人兽共患病毒性疾病。该病毒主要通过携带病毒的蚊虫叮咬传播，猪是其主要增殖宿主和扩散宿主。该病可导致妊娠母猪流产、产死胎或弱仔，公猪睾丸炎，育肥猪持续高热，新生仔猪呈神经症状等，给养猪业造成巨大的经济损失。该病是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，目前尚无特效治疗药物，严重威胁着人类的健康。对猪进行疫苗免疫可以有效减少JEV对养猪业造成的危害，同时对JEV进行快速、准确的检测具有十分重要的意义。本文详细综述了猪乙型脑炎病毒近年来的检测方法研究进展，以期为快速诊断和防治该病提供参考。

1 血清学检测方法

1.1 凝结性试验

1.1.1 血凝抑制试验（HI）。该法是流行病学调查和临床诊断中最常用的方法。JEV HI抗体出现较早，一般在发病后4～5 d开始出现，2周左右达到髙峰，可维持1年左右。因此测定HI抗体可用于早期诊断。HI抗体存在于IgM和IgG免疫球蛋白中，IgM出现在早期，因此鉴定动物抗体是IgM还是IgG有早期诊断意义。如果是IgM，表示该动物是新近感染；若不是IgM，则说明该动物早就被感染。HI试验敏感性强，操作简单，但对于临床上的单个病例需要双份血清才能确诊。

1.1.2 被动血凝试验（PHA）。周立桥等[1]运用PEG纯化的抗原来致敏醛化的绵羊红细胞建立PHA试验，检测猪和人血清中的JEV抗体，发现其具有较高的敏感性。陈伯权[2]用JEV单克隆抗体（McAb14）致敏羊血球，做反向被动血凝试验（RPHA）用来检测乙脑抗原，发现其具有较高的特异性。

1.1.3 胶凝集试验（LAT）。贾杏林等[3]研制的LAT检测试剂盒与HI的总符合率接近90%，且LAT具有简便、快速、灵敏性高和特异性较好等优点，适用于大规模乙脑抗体的检测。

1.1.4 SPA协同凝集试验（SPA-CoA）。宋大伟等[4]应用新型SPA协同凝集试验（SPA-CoA）检测JEV抗体，并与HI进行了对比，结果发现二者的阳性符合率和总符合率较高。新型SPA-CoA更为简便和实用，且不需要专门的实验器材，特别适用于基层的早期现场检测。

1.2 中和试验（NT）

中和试验是国际公认的乙脑病毒血清学检测金标准。该方法也是采取双份血清进行诊断，特异性高，但操作复杂且耗时，仅用于实验室检验，在临床中很少应用。

1.3 补体结合试验（CT）

补体结合试验（CT）是诊断乙脑的一种常用方法。一般在发病早期和恢复期（病后2～3周以上）各采血1次，并在同1次CT中进行测定。如果恢复期血清比发病早期血清的效价高4倍以上，才能判定为阳性。因此CT方法只适用于对乙脑的确诊，常作为回顾性诊断，不宜用于疾病的快速诊断。

1.4 荧光抗体技术

1.4.1 荧光抗体染色法。许基龙等[5]用冰冻荧光抗体染色的方法检测到了组织中的JEV。侯世宽等[6]以辣根过氧化物酶为标记物，过碘酸钠法标记兔抗猪IgG制备酶标记抗原，经Sephadex G-200纯化后，用以检测和鉴定组织培养系统中的JEV抗原，证明其有较好的特异性和敏感性。

1.4.2 间接免疫荧光（IFA）。李钟铎[7]用JEV感染BHK-21细胞固定后作IFA染色的底物，建立了检测乙脑抗体的IFA方法，并与HI及CF法进行对比，结果发现微量免疫荧光法最敏感。朱兆奎等[8]用JEV感染的C6/36白蚊伊蚊细胞制备抗原片和用FITC标记兔抗猪IgG抗体建立了IFA方法。临床试验表明该方法能用于猪乙脑血清流行病学调査。王吉等[9]建立的IFA方法灵敏度是LAT试验的8倍。IFA由于其操作繁琐，血清中的非特异性吸附及荧光显微镜等的限制，仅限于实验室使用。

1.5 斑点金免疫渗滤检测法（Dot immunogold filtration assay，DIGFA）

王祥等[10]建立了一种以固相滤膜为载体，以红色胶体金颗粒标记的兔抗猪IgG作为探针，特异性地检测JEV抗体的DIGFA法。本法数分钟内即可用肉眼观查结果，适合于乙脑快速诊断和大规模血清流行病学调查，但不能准确定量和自动分析。

1.6 胶体金免疫层析法（Gold immunochromatography assay，GICA）

Li等[11]用胶体金标记单克隆抗体2A2使之与JEV的E蛋白结合，形成的结合物再与单克隆抗体4D1结合建立的GICA方法可以检测到2.5PFU的JEV，与RT-PCR比较其特异性与灵敏度分别达到了99.3%和85.7%。田纯见等[12]也建立了乙脑抗体的GICA检测方法。GICA是一种简便、快速、特异、灵敏的检测方法，适合于样品的快速检测和基层的推广使用，缺点是不能准确定量和自动分析。

1.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.7.1 间接ELISA。孙圣福[13]分别建立了检测JEV全病毒和E蛋白的间接ELISA方法并研制试剂盒，用两种试剂盒对97份血清进行了同步检测，发现两者符合率为95.8%，均比HI方法阳性检出率高。沈婷等[14]用JEV弱毒疫苗株作为包被抗原建立了间接ELISA方法，其阳性检出率明显高于LAT方法。贾杏林等[15]、黄少梅[16]、谌剑波等[17]、李晓华等[18]先后应用建立的间接ELISA方法对当地采采集的血样进行了抗体检测。Konishi等[19]、吴鹏等[20]先后应用重组的NS1蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法。祖立闯等[21]、钟泽栋[22]以JEV重组E蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法并组装试剂盒。张丽颖等[23]、郭锐等[24]先后用原核表达系统表达JEV的E蛋白和ED III蛋白建立了间接EL1SA方法。间接ELISA方法为临床JEV血清抗体检测及其疫苗的免疫效果评价提供了技术手段。马淑娟等[25]比较我国3种商品化ELISA试剂盒的诊断效果，结果发现目前商品化猪乙脑病毒血清IgG抗体ELISA检测试剂盒诊断结果差异较大，与中和试验相比存在较高的假阴性，质量有待提高。

1.7.2 双抗体夹心ELISA（DS-ELISA）。张宁[26]在对JEV E蛋白基因克隆和表达的基础上建立了双抗体夹心ELISA法并组装试剂盒，发现其敏感性、特异性及可重复性达到了实验要求。张芯铨[27]也研制出双抗体夹心ELISA试剂盒用于乙脑的检测。

1.7.3 Dot-ELISA。Solomon等[28]建 立 了 IgM Dot-ELISA快速诊断JEV的方法。Dot-ELISA方法采用对蛋白质吸附能力极强的硝酸纤维素膜（NC膜）为固相载体，结果可用肉眼判定，可在包括基层兽医防疫单位在内的各领域完成对猪血清抗体的检测，更便于在基层推广应用。

1.7.4 IgM抗 体 捕 获ELISA（Mac-ELISA）。Jacobson等[29]、Shukla等[30]等对乙脑的IgM抗体捕获ELISA方法进行了研究。Mac-ELISA解决了由于IgM抗体在体内含量较少用常规ELISA检测不能获得满意结果的问题，已较普遍地应用于乙脑的早期诊断。

1.7.5 抗原捕获ELISA（AC-ELISA）。王晓磊等[31]以JEV prM-E蛋白特异性单克隆抗体（McAb）作为捕获抗体和检测抗体建立了抗原捕获ELISA方法，为JE亚单位疫苗的研制与生产奠定了基础。

2 病原学检测方法

2.1 病毒的分离与鉴定

病原的分离与鉴定是猪乙型脑炎检测最为直接、经典的方法。无菌采取可疑的病料，如流产和死产胎儿的脑、肺、肝、睾丸和胎盘等，接种到乳鼠脑组织或细胞（BHK-21、C6/36、Vero等）进行分离。根据乳鼠出现的症状和细胞的病变（病毒在BHK-21、Vero细胞上产生的病变是圆缩、脱落及破裂，在C6/36细胞上可观察到细胞融合形成的空泡，在琼脂糖或甲基纤维素覆盖下能形成蚀斑）进行判定。获得病毒后，用JEV标准毒株和标准阳性血清或分子生物学等方法进行鉴定。病毒分离与鉴定结果准确，但因其操作繁琐，试验条件要求高，耗时且影响因素多，不能实现乙脑的快速检测。

2.2 分子生物学方法

2.2.1 RT-PCR。许多学者用乙脑病毒的E、C、NS1、NS3等特异基因设计RT-PCR引物，对乙脑做快速检测，均得到很好的检测效果。崔奕杰等[32]、李茂宁等[33]、王伟杰[34]、李天芝等[35]根据E基因设计引物；孙静等[36]根据NS3基因，孙圣福[37]、车勇良等[38]根据NS1基因，高正琴等[39]根据C基因分别设计引物，建立的RT-PCR方法最低可检出10 pg的DNA。Swami等[40]进行了多重RT-PCR与ELISA的比较试验，结果发现，多重RT-PCR比ELISA更适合应用于JEV的早期检测。蔡绪禹等[41]根据猪乙脑病毒等5种人兽共患脑炎病毒的基因序列，建立了可同时检测5种病毒的多重RT-PCR方法。何玢等[46]建立了与乙脑病毒相关的8种虫媒病毒的多重RT-PCR检测方法并应用于临床检测。

2.2.2 荧光定量RT-PCR。Jeong等[42]在JEV的3´端非编码区用荧光染料SYBR Green I构建了实时荧光定量RT-PCR来检测乙脑病毒，灵敏度可达15 TCID50。刘卫滨等[43]根据JEV NS5基因、黄福新等[44]根据NS3基因、霍红等[45]根据E基因分别设计引物与探针，建立了TaqMan荧光定量RTPCR并成功应用于猪血清样品的检测。该方法是常规PCR灵敏度的100倍。

2.2.3 RT-LAMP。逆转录环介导等温扩增（RTLAMP）技术是一种快速、敏感、可靠、成本低廉的方法。卢冰霞等[46]、李海洋等[47]先后根据JEV E基因设计4条特异性LAMP引物，建立了RT-LAMP方法，方便了临床上对JEV的大批量快速筛查。田纯见等[48]根据JEV NS3基因、孙圣福等[49]根据M基因设计引物，也建立了RTLAMP方法。RT-LAMP方法操作简便、时间短，对仪器设备要求较低，肉眼下即可观察结果，特别适合基层单位和野外的使用。

2.2.4 PCR-ELISA微板杂交法。PCR-ELISA将基因扩增、核酸杂交和酶联显色3种诊断技术融为一体，具有特异性强、灵敏度高、操作简单等特点。任瑞文等[50]分别设计了黄热及乙脑病毒的特异性捕获探针及信号探针，建立了快速检测黄热病毒及乙脑病毒的PCR-ELISA微板杂交法。

2.2.5 基因芯片技术。张焕容等[51]构建了伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）和乙脑病毒检测基因芯片。该基因芯片技术可对PRV、PPV和JEV进行同步检测和鉴别诊断。张仙[52]选取PRRSV的Y11基因、CSFV的PS8基因和JEV的C基因设计探针，进行了PRRSV-CSFV-JEV直观可视化基因芯片的构建，对四川102份临床样本进行检测，发现与常规RT-PCR方法的符合率高于97.5%。

3 小结

猪乙型脑炎是重要的人兽共患病之一，威胁人类的健康和养殖业的发展。提高乙脑病毒检测的质量和效率，需要根据病程的发展建立完善的检测体系和策略，并结合分离培养、血清学、分子生物学等技术，科学选择合理的方法进行检测。随着微生物基因组学、现代分子生物学技术的快速发展，传统的检测技术不断完善，新技术及仪器的不断开发和使用，必将实现乙脑病毒的快速、准确、灵敏、特异、自动化检测，达到疾病早发现、早预防的目的，为猪乙型脑炎的防治提供时间和技术保障，也为畜牧业生产减少经济损失，获得更大的经济效益。

[1] 周立桥，陈伯权，安节. 被动血凝快速检测乙脑方法的建立[J]. 动物检疫，1994，11（1）：5-6.

[2] 陈伯权. 单克隆抗体反向被动血凝和反向被动血凝抑制试验在乙脑快速诊断中的应用[J]. 中华微生物和免疫学杂志，1987，7（1）：43-45.

[3] 贾杏林，陈焕春，何启盖，等. 猪乙型脑炎乳胶凝集试验与血凝抑制实验方法的比较[J]. 中国预防兽医学报，2003，25（5）：390-392.

[4] 宋大伟，魏建超，郑其升，等. 新型SPA协同凝集试验与血凝抑制试验检测猪乙型脑炎病毒特异性抗体的比较[J].畜牧与兽医，2006，38（6）：44-46.

[5] 许基龙，胡敬尧，武德丽，等. 应用乙脑荧光抗体直接染色法快速鉴定乙型脑炎病毒的初步结果[J]. 兽医大学学报，1981（4）：44-46.

[6] 侯世宽，殷震，江曙光，等. 应用酶标记抗体法检测乙型脑炎病毒抗原的初步试验[J]. 兽医大学学报，1981（2）：32-36.

[7] 李钟铎，宋光昌. 微量荧光抗体染色技术[J]. 流行病学杂志，1980（2）：108-109.

[8] 朱兆奎，张曦，滕峥，等. 猪乙脑病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用[J]. 中国人兽共患病杂志，2006，22（2）：150-152.

[9] 王吉，高正琴，卫礼，等. 乙型脑炎病毒免疫荧光检测方法的建立[J]. 实验动物科学，2010（4）：1-5.

[10] 王祥，陈焕春，吴斌，等. 猪乙型脑炎血清抗体DIGFA检测方法的建立与应用[J]. 畜牧兽医学报，2002，33（2）：200-204.

[11] LI Y，HOU L，YE J，et al. Development of a convenient immunochromatographic strip for the diagnosis of infection with Japanese encephalitis virus in swine[J]. Journal of virological methods，2010，168（1/2）：51-56.

[12] 田纯见，贾坤，林志雄，等. 检测猪乙型脑炎抗体胶体金免疫层析法的建立与初步应用[J]. 广东畜牧兽医科技，2013，38（2）：21-25.

[13] 孙圣福. 日本乙型脑炎实验室诊断方法的研究和应用[D]. 武汉：华中农业大学，2004.

[14] 沈婷，周斌，陈溥言. 检测猪乙型脑炎病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用[J]. 畜牧与兽医，2010，42（4）：1-7.

[15] 贾杏林，陈焕春，王祥，等. 猪乙型脑炎间接ELISA与血凝抑制试验方法的比较[J]. 中国畜牧兽医，2011，38（2）：157-159.

[16] 黄少梅. 猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定[D]. 武汉：华中农业大学，2013.

[17] 谌剑波，欧阳睿曦，王剑，等. 铜仁地区某规模化猪场猪乙型脑炎的血清学检测[J]. 黑龙江畜牧兽医，2015（5）：86-87.

[18] 李晓华，魏春华，戴爱玲，等. 龙岩市猪流行性乙型脑炎的流行病学调查[J]. 黑龙江畜牧兽医，2017（2）：119-122.

[19] KONISHI E，KITAI Y. Detection by ELISA of antibodies to Japanese encephalitis virus NS1 protein induced in subclinically infected humans[J]. Vaccine，2009（27）：7053-7058.

[20] 吴鹏，曹瑞斌，周斌，等. 乙脑病毒非结构蛋白NS1的原核表达及重组蛋白间接ELISA方法的初步建立[J]. 畜牧与兽医，2010，42（3）：9-12.

[21] 祖立闯，沈志强. 猪乙型脑炎病毒间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的研制及其应用[J]. 养猪，2011（5）：98-102.

[22] 钟泽栋. 猪流行性乙型脑炎病毒间接ELISA抗体检测试剂盒的研究[D]. 雅安：四川农业大学，2012.

[23] 张丽颖. 猪乙型脑炎病毒的分离鉴定、致弱及间接ELISA检测方法的建立[D]. 南京：南京农业大学，2011.

[24] 郭锐，田永祥，周丹娜，等. 猪乙型脑炎病毒E-Ⅲ抗原域蛋白间接ELISA的建立及应用[J]. 湖北农业科学，2012，51（22）：5120-5122.

[25] 马淑娟，熊益权，张琼花，等. 三种ELISA试剂盒检测猪流行性乙型脑炎病毒血清IgG抗体比较[J]. 中国人兽共患病学报，2015，31（5）：423-426.

[26] 张宁. 猪流行性乙型脑炎双抗夹心ELISA方法的建立与试剂盒的制备[D]. 长春：吉林大学，2011.

[27] 张芯铨. 猪流行性乙型脑炎双抗体夹心ELISA检测试剂盒的研究[D]. 雅安：四川农业大学，2012.

[28] SOLOMON T，THAO L T，DUNG N M，et al. Rapid diagnosis of japanese encephilitis by using an immunoglobulin M Dot enzyme immunoassay[J].Journal of clinical microbiology，1998，36（7）：2030-2034.

[29] JACOBSON J A，HILLS S L，WINKLER J L，et al. Evaluation of three Immunoglobulin M antibody capture enzyme-linked immunosorbent assays for diagnosis of Japanese encephalitis[J]. American journal of tropical medicine and hygiene，2007，77（1）：164-168.

[30] SHUKLA J，BHARGAVA R，DASH P K，et al. Cloning and expression of domain III of the envelope gene of Japanese encephalitis virus：evaluation for early clinical diagnosis by IgM ELISA[J]. Virol methods，2009，158（1/2）：165-170.

[31] 王晓磊，霍红，郭立平，等. 猪流行性乙型脑炎病毒prM-E抗原捕获ELISA检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2015，37（6）：465-468.

[32] 崔奕杰. 猪乙型脑炎病毒检测方法的建立[D]. 保定：河北农业大学，2006.

[33] 李茂宁，赵武，陈云霞，等. 日本脑炎病毒套式RTPCR方法的建立与初步应用[J]. 动物医学进展，2009，30（12）：5-8.

[34] 王伟杰. 猪乙型脑炎病毒RT-PCR检测方法的建立及乙脑病毒四川分离株PrM/E基因的序列分析[D]. 雅安：四川农业大学，2010.

[35] 李天芝，于新友，莫玲，等. 基于E基因的猪乙型脑炎病毒一步法RT-PCR快速检测方法的建立和应用[J]. 猪业科学，2015，32（5）：78-80.

[36] 孙静，陶三菊. 逆转录一聚合酶链反应方法检测乙型脑炎病人标本[J]. 中华实验和临床病毒学杂志，2000，14（2）：84-187.

[37] 车勇良，陈少莺，魏宏，等. 猪乙型脑炎病毒RTPCR检测方法的建立[J]. 福建农业学报，2006，21（3）：228-230.

[38] 高正琴，贺争鸣，邢瑞昌，等.乙脑病毒嵌套式RTPCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中国人兽共患病杂志，2005，21（4）：279-282.

[39] SWAMI R，RATHO R K，MISHRA B，et al. Usefulness of RT-PCR for the diagnosis of Japanese encephalitis inclinical samples[J]. scandinavian journal of infectious diseases，2008（40）：815-820.

[40] 蔡绪禹，康晓平，刘洪，等. 5种脑炎人兽共患病病毒多重RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2011，33（2）118-121.

[41] 何玢，王环宇，张晨，等. 8种脑炎相关虫媒病毒GeXP检测方法的初步建立[J]. 病毒学报，2012，（1）：57-62.

[42] JEONG H S，SHIN J H，PARK Y N，et al. Development of real-time RT-PCR for evaluation of JEV clearance during purification of HPV type 16 L1 virus-like particles[J].Biological，2003，31（3）：223-229.

[43] 刘卫滨，付士红，宋宏，等. 乙型脑炎病毒TaqMan PCR检测方法的建立及初步应用[J]. 中华微生物学和免疫学杂志，2005，25（5）：656-662.

[44] 黄福新，高世同，张仁利，等. 乙型脑炎病毒TaqMan逆转录聚合酶链反应检测方法的建立[J]. 中国热带医学，2008，8（9）：1481-1482.

[45] 霍红，李业南，薛遥，等. 猪流行性乙型脑炎病毒TaqMan荧光定量PCR方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2014，36（7）：547-550.

[46] 卢冰霞，刘磊，秦毅斌，等. 猪流行性乙型脑炎RTLAMP方法的建立与初步应用[J]. 安徽农业科学，2013，41（12）：5359-5361.

[47] 李海洋，殷秀辰，饶柏钟，等. 猪乙型脑炎病毒Ⅰ、Ⅲ型的RT-LAMP检测方法建立与应用[J]. 畜牧与兽医，2015，47（5）：26-30.

[48] 田纯见，林志雄，罗长保，等. 猪日本脑炎病毒NS3基因实时RT-LAMP快速检测方法的建立[J]. 动物医学进展，2009，30（12）：34-39.

[49] 孙圣福，陈静，田夫林，等. 日本乙型脑炎LAMP方法的建立和应用[J]. 中国畜禽种业，2015（5）：34-35.

[50] 任瑞文，方美玉，洪文艳，等. 微孔杂交快速检测黄热病及乙型脑炎病毒方法的建立[J]. 中华检验医学杂志，2004，27（12）：540-540.

[51] 张焕容，曹三杰，文心田，等. 猪伪狂犬病、猪细小病毒病和猪流行性乙型脑炎检测基因芯片的制备及检测方法研究[J]. 中国预防兽医学报，2007，29（10）：796-801.

[52] 张仙. 猪蓝耳病、猪痘、流行性乙型脑炎可视化共检基因巧片的构建及初步应用[D]. 雅安：四川农业大学，2015.

（责任编辑：杜宪）

Research Progress on the Detection Methods of the Japanese Encephalitis Virus

Zhuang Jinqiu，Mei Jianguo，Zhang Ying，Mo Ling，Li Feng，Shen Zhiqiang
（Binzhou Animal Science & Veterinary Medicine Academy，Binzhou，Shandong 256600）

Japanese encephalitis（JE）has caused serious damage to human health and great economic losses to the swine industry in the world. The research progress of the latest laboratory detection methods of Japanese encephalitis virus was summarized，in order to provide reference for the prevention and control of this disease.

Japanese encephalitis；Japanese encephalitis virus；detection method；research progress

855.9+9

B

1005-944X（2017）11-0060-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.11.017

山东省重点研发计划项目（2015GSF121027）；山东省现代农业产业技术体系生猪产业创新团队项目（SDAIT-08-17）