基于高通量测序技术的菌根共生研究概况

刘思琪，赵明明

(1.中国中药公司，北京 100195；2.中国医学科学院 北京协和医院药用植物研究所，北京 100193)

·综述·

基于高通量测序技术的菌根共生研究概况

刘思琪1，赵明明2*

(1.中国中药公司，北京100195；2.中国医学科学院 北京协和医院药用植物研究所，北京100193)

菌根是自然界中普遍存在的一种共生现象，它是由土壤中的菌根真菌与高等植物根系形成的一种共生体。鉴于其在自然界中的重要作用，菌根研究日益引起世界各国学者的普遍关注。本文归纳总结了主要菌根互作类型丛枝菌根、外生菌根和兰科菌根利用高通量测序技术的研究进展。

高通量测序；丛枝菌根；外生菌根；兰科菌根

大约有90%的陆地植物可与土壤菌根真菌共生，形成菌根。菌根的形成在土壤结构、植物养分吸收与生长、生物多样性及农业和自然生态系统的生产力等方面发挥重要作用[1]。根据形态结构的不同，菌根可分为丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)、浆果鹃类菌根(Arbutoid mycorrhiza)、外生菌根(Ectomycorrhiza，EM)、欧石南类菌根(Ericoid)、石晶兰类菌根(Monotropoid mycorrhiza)和兰科菌根(Orchid mycorrhiza)。其中最普遍且最有经济价值的两大类当属与农业中绝大部分的谷类作物、蔬菜和水果等共生的丛枝菌根以及与树木、灌木共生的外生菌根。

1 丛枝菌根

丛枝菌根(AM)真菌是一类以特定的形式定植于植物体根细胞，从而协调植物生长的真菌种类。AM真菌从特定的接口入侵植物，从而建立共生关系[2]。基于分子生物学的丛枝菌根共生研究已开展多年，并取得了一定成果。在植物方面，已经建立有关AM共生cDNA的文库，通过抑制性消减杂交技术获得大量的克隆，测序得到AM共生相关表达序列标签EST[3]等方面的工作。所获得的ESTs可以转移到固相载体(阵列)，从而使不同来源获得的cDNA杂交RNA以积累AM共生过程中的基因表达概况；在真菌方面，EST库也正在建立，同样采用的是直接克隆及抑制性消减杂交技术。双方的互作关系主要表现为一些相关基因的调节和功能验证，以及各自在共生体系中扮演的角色，这已成为科学界关注的热点[4]。

蒺藜苜蓿Medicagotruncatula和百脉根Lotusjaponicas作为AM菌根互作研究的模式植物[5-6]，已分别进行了基因组测序和突变体筛选[7-9]等方面的研究。Frenzel等[10]已成功构建的随机cDNA文库MtAMP，来源于蒺藜苜蓿与丛枝菌根真菌Glomusintraradices共生后的主要发育阶段的组织样品，文库中共包含了5’端ESTs 3448条。Journet等[11]也在2002年构建了含有8567条ESTs的蒺藜苜蓿和丛枝菌根真菌G.intraradices的随机cDNA文库MtBC。随后，Liu等[12]在2003年建立了包含9030条ESTs的蒺藜苜蓿和丛枝菌根真菌G.versiforme的随机cDNA文库MHAMHE MHAM2。由于从随机文库中发现高表达的基因是比较困难的，研究趋势转为用差减测序技术替代随机cDNA文库技术[13]。在采用抑制差减杂交(SSH)cDNA文库方法建立的蒺藜苜蓿和丛枝菌根真菌根的差减杂交EST文库MtGIM中，对照组分别是未被侵染的根、磷酸盐处理的根、苜蓿根瘤菌Sinorhizobiummeliloti侵染的根和豌豆褐斑菌Aphanomyceseuteiches侵染的根，共获得了1686条ESTs，这些序列中很大一部分被证明是菌根诱导相关基因[14-15]。AM菌根真菌G.mosseae建立了附着胞生长相关的SSH cDNA文库，获得658条ESTs，这些序列被用于研究共生最早期的真菌基因表达[16]。Ouziad等[17]对AM菌根真菌G.intraradices进行不同外源因子刺激后，菌丝生长的SSH cDNA文库中共获得2059条ESTs。Hildebrandt等[18]以G.intraradices的萌发孢子和向外缘生长的菌丝为材料构建的2个SSH cDNA文库中，共获得3708条ESTs。由菌根组织获得的ESTs中，真菌序列低于10%，而来源于AM根的序列主要用于发现与菌根共生的建立和功能相关的植物基因[19-20]。

微列阵技术也是近年来研究有多少基因能相互作用以及一个细胞网如何同时控制大量基因的新方法。微阵列分为cDNA微阵列和寡聚核苷酸微阵列。微阵列技术就是利用分子杂交原理，使同时被比较的标本(用同位素或荧光素标记)与微阵列杂交，通过检测杂交信号强度及数据处理，把他们转化成不同标本中特异基因的丰度，从而全面比较不同标本的基因表达水平的差异[21]。微阵列技术是一种探索基因组功能的有力手段[22]。在蒺藜苜蓿M.truncatula中首先建立了含有6359个EST簇的根的微阵列Mt6k-RIT[23]。这些序列代表了来源于氮缺乏根的cDNA文库、幼小根瘤cDNA文库和AM菌根cDNA文库的21 473条ESTs[24]。基于花和豆荚随机cDNA文库中的2516条ESTs、1776个cDNA克隆经聚合酶链式反应(PCR)扩增后补充到Mt6k-RIT中，建立了新的Mt8k cDNA芯片，该芯片上大约有6300个M.truncatula的基因探针[25]。关于豆科模式植物M.truncatula的其他基因组表达分析还包括AM菌根的2.5 k cDNA宏阵列和6 k微阵列[26-27]。近几年来cDNA探针逐渐被70mer寡聚核苷酸代替[28]。

2 外生菌根

以欧洲山杨Populustremula和毒蝇鹅膏Amanitamuscaria为外生菌根互作研究的模式共生体系中，已建立了含有6669条ESTs的随机cDNA文库[29]。以外生菌根真菌A.muscaria在低氮源的葡萄糖培养基上生长的菌丝和无葡萄糖高氮源培养基上生长的菌丝为对照组，构建的SSH cDNA文库中，共获得582条ESTs。外生菌根真菌Hebelomacylindrosporum建立了不同氮源条件下菌丝生长的随机cDNA文库，共获得459条ESTs[30]。未来研究可能更多采用差异表达分析策略，鉴定菌根共生互作过程的活性基因，这些策略基于高通量EST测序、EST聚类和注释、菌根相关基因表达的生物信息学分析及基于基因芯片技术的转录组分析。

3 兰科菌根

兰科菌根是一种内生菌根，主要寄生于兰科(Orchidaceae)植物的种子及根系上。目前已开展对兰科菌根真菌的分类及真菌资源多样性、兰科菌根的形态和菌根对兰科植物的效应等最新的研究[31]。研究表明，感染兰科植物根部并能与之共生的真菌绝大多数属于担子菌门(Basidiomycota)和半知菌门(Deuteromycotina)，也有部分属于子囊菌门(Ascomycota)；兰科菌根的形成可分为两种情况：一是对兰科植物种子的侵染；二是对成长新根的侵染[32]。菌根真菌对兰科植物的种子萌发和植株生长发育均有一定影响。

遗传信息的丰富不仅有利于发现功能基因，也对未来基因组注释有帮助，对观赏性兰花黄花杓兰Cypripediumflavum菌根形成的差异基因表达研究中，首次获得兰科菌根共生相关差异表达ESTs[33]。以11种蝴蝶兰属兰花的cDNA文库中的37 979 342条序列[34]构建了兰科数据库OrchidBase，其中41 310条ESTs是由Sanger法获得的，37 908 032条ESTs由第二代测序技术获得，包括Roche 454测序技术和Solexa Illumina测序技术所获得的ESTs经过聚类分析，分为8501个重叠群(contigs)和76 116单一序列(singletons)，平均片段长度为459 bp。该数据库是基于网络的兰科EST数据库，不仅能查询到相关的EST数据信息，还提供了聚类信息、功能注释、基因分析(gene ontology)和代谢途径分析[35-36]。兰科数据库是第一个在线的兰科EST序列整合信息库，可以自由地上传或下载相关数据信息[37]。从基因的分子水平和功能分析水平上都为兰科植物研究提供了丰富的遗传数据信息。

铁皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo为兰科(Orchidaceae)石斛属Dendrobium名贵药材，其种子细小如粉，自然条件下需共生真菌侵染以提供萌发所需的碳、氮源等营养元素。真菌侵染兰科植物种子，形成共生关系是兰科种子萌发的前提，但共生机理尚不清楚。在分子水平上揭示兰科种子共生萌发成为近来科学界关注的热点。赵明明等(2013)以铁皮石斛种子接种蜡壳菌属真菌Sebacinasp.共生萌发至第三阶段的组织样品成功构建抑制性差减杂交cDNA文库。测序分析共获得1437个EST标签，聚类拼接得到1074个unigenes，包括172个重叠群(contigs)和902个单一序列(singletons)。真核生物蛋白相邻类聚簇族(KOG)数据库近似蛋白功能分类、基因本体(GO)注释及京都基因与基因组百科全书(KEGG)途径分析发现，植物来源蛋白涉及23个功能类群，主要包含在信号转导、抗逆境胁迫及代谢等途径中[38]。

我国丛枝菌根、外生菌根和兰科菌根资源均非常丰富，随着对菌根资源的药用价值和食用价值认识的不断深入，越来越多的学者更加关注菌根互作分子生物学领域的研究，通过高通量测序技术、微列阵技术、差减文库技术深层挖掘菌根互作过程中分子水平的基因表达信息，这些研究成果为今后菌根资源的合理开发、利用和保护提供了有力的理论依据。

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ProgressofMycorrhizalSymbiosisAnalysisUsingHighThroughputSequencing

LIU Siqi1，ZHAO Mingming2*

(1.ChinaNationalTraditionalChineseMedicineCorporation,Beijing100195,China;2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment,ChineseAcademyofMedicalSciencesPekingUnionMedicalCollage,Beijing100193,China)

Mycorrhiza is a common existence in nature, and it is a symbiosis formed by mycorrhizal fungi in soil and roots of higher plants. In view of its important role in nature, mycorrhizal research has attracted more and more attention from scholars all over the world. In this paper, we summarized recent progresses in the research of arbuscular mycorrhiza，ectotrophic mycorrhiza and orchidaceous mycorrhiza symbiosis using high throughput sequencing.

High throughput sequencing；Arbuscular mycorrhiza；Ectotrophic mycorrhiza；Orchidaceous mycorrhiza

] 赵明明，博士后，研究方向：中药资源学，E-Mail：mmzhao@icmm.ac.cn

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.5.029

2017-05-11)

*[