猪伪狂犬病PCR与ELISA检测方法研究进展

王艳斌，赵礼军，申艳玮

（1.河南省济源市动物卫生监督所，河南济源 459000；2.山东德州市畜产品质量安全监督所经济技术开发区分所，山东德州 253000）

猪伪狂犬病PCR与ELISA检测方法研究进展

王艳斌1，赵礼军1，申艳玮2

（1.河南省济源市动物卫生监督所，河南济源 459000；2.山东德州市畜产品质量安全监督所经济技术开发区分所，山东德州 253000）

猪伪狂犬病（PR）在全球广泛流行，给猪养殖业造成了严重的损失。如何实现对该病快速、准确、方便、价廉地的诊断具有重要意义。PCR和 ELISA具有操作简便、灵敏度高、结果判定简单、成本低等优点，可广泛应用于一线兽医队伍快速检测PR。本文就PCR和ELISA技术在猪伪狂犬病诊断方面的最新研究情况进行了综述，以期为PR的快检快筛检测提供参考。

猪伪狂犬病；检测；PCR；ELISA

猪伪狂犬病（Pseudorabies，PR）又称奥叶基氏病（Aujeszky's disease，AD）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus，PRV）造成的，以发热和脑脊髓炎为主要特征的急性接触性传染病。猪是PRV主要宿主，隐性感染猪可长期带毒并排毒，是该病的主要传染源，是造成PRV在猪场中难以根除并长期流行的主要原因。各个年龄阶段的猪均可感染PRV。幼龄哺乳仔猪发病率和死亡率可高达100%；成年猪感染无明显临床症状或呈隐性感染；妊娠母猪感染后发生流产和产死胎、木乃伊胎，种猪感染导致不育。PRV只有一个血清型。目前广泛采用gE基因缺失株作为疫苗毒株[1]。1947年我国首次报道发现了该病，20世纪60～70年代出现强毒株并在全球散播，20世纪80年代该病在我国呈暴发式流行。该病呈全球流行性，给养猪业造成了严重的损失，目前该病仍在全国流行并出现了变异强毒株[2]。如何快速准确的检测PRV以及隔离淘汰病猪，对PR的防控、治疗与扑灭具有重要的意义。聚合酶链反应技术（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA），具有操作简便、灵敏度高、结果判定简单、成本低等优点，广泛的应用于快速检测PRV，现就PCR和ELISA技术在PR诊断中的应用及研究进展进行简要综述。

1 PCR在PR检测方面应用进展

目前有多种检测PRV的PCR试剂盒上市。最新开发的PCR检测方法多为多重RCR，可同时完成对多种常见猪病病原的检测，有效增加了检测范围并提高了检测效率。

2013年Ma等[3]设计了可以区别野生型PRV与疫苗毒株的nanoPCR。该方法通过检测gB蛋白保守序列，来判定样品中是否含有PRV；通过检测是否含有疫苗毒株缺失的gE蛋白序列，来判定样品是否感染野生型PRV，并使用该方法检测110份接种过PRV疫苗的猪样品发现仍然有53%的样品感染野生型毒株。2015年Luo等[4]研发了可同时检测PRV和猪博卡病毒（PBoV）的nanoPCR。该方法使用了两对特异引物，可扩增出316 bp的PRV保守序列和996 bp 的PBoV保守序列，最低可检测到6个PRV保守序列的重组质粒或95个PBoV保守序列的重组质粒，灵敏度较普通PCR分别提高了100倍和1000倍。使用该方法检测550份临床样品，检测结果与商品化PCR试剂盒相同。2015年Hu等[5]设计研发了可同时检测猪瘟病毒、非洲猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、PR和猪蓝耳病病毒的普通PCR，该方法使用了5对特异性引物，在同一个反应中，其最低检测限分别为为1.09×104、1.50×103、 2.10×103、1.30×103和 8.97×102个重组DNA质粒，使用该方法检测46份临床样品，检测结果与国标法检测结果相同。

在应用qPCR检测PRV方面。2010年Song等[6]开发了能够检最低检测到1 × 102含目的蛋白重组质粒，的Taqman荧光探针qPCR方法，使用该方法和普通PCR平行检测41份临床样品，检测到32份呈阳性，普通PCR检测到11份呈阳性，检测灵敏度较普通PCR大幅提高，显示了更好的应用前景。2012年Pérez 等[7]设计了可以同时检测猪圆环病毒、猪细小病毒、PRV和Torque teno sus virus 1 型和2 型病毒的qPCR方法，该方法同时可以检测到3.65×103到 5.04×103个含病毒目的 DNA的重组质粒。通过样品检测证明该方法的检测结果与每种病毒的PCR检测方法检测结果一致。2014年Wu[8]建立了可同时检测猪圆环病毒、猪蓝耳病毒、PRV、猪瘟病毒、猪细小病毒、和乙型脑炎病毒等6种病毒的TaqMan探针qPCR方法，该方法最低能检测到每毫升含有10 个猪圆环病毒、PRV、猪瘟病毒目的 DNA重组质粒，使用该方法检测118份临床样品，与检测单个病毒的PCR方法检测结果符合率达99.2%。

在应用新PCR及相关技术检测PRV方面。2015年Chen 等[9]运用Luminex公司基于PCR和磁珠技术开发的xMAP技术，开发出了可同时检测PRV、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒和猪细小病毒的方法。该方法可同时实现对RNA病毒和DNA病毒的实时定量检测，且检测速度快，在2h内便可完成检测。通过检验临床样品证实，该方法的灵敏度高于普通PCR，与qPCR相同。2015年Zhang 等[10]开发了可以同时检测猪蓝耳病病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流感病毒（H1和H3亚型）、猪圆环病毒、PRV和乙型脑炎病毒，共计9种病毒的GeXP（Genome Lab Gene Expression Prof i ler）方法。该方法使用了9对检测引物，引物由5'端通用检测引物和与之相连的扩增单个病毒目的DNA片段引物构成，该方法检测单种病毒时，最低检测到含病毒目的DNA的重组质粒浓度分别为1000 个/µL 含PRV的重组质粒，100个/µL含猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒和乙型脑炎病毒目的基因的重组质粒，10 个/µL含猪流感病毒（H1和H3亚型）和猪蓝耳病病毒目的基因的重组质粒。使用该方法检测114 份临床样品，检测结果与使用单种病毒qCPR或RT-PCR检测结果相符合，并且具有相同的检测敏感性和特异性。

此外，很多文献对检测PRV的PCR方法进行了系统、科学、严谨地评判，有效证明了在检测PRV方面，PCR具有良好的特异性和灵敏性，可大规模推广应用。2012年 Zanella等[11]使用病毒分离法和qPCR同时检测1027份临床鼻拭子，统计结果显示:与病毒分离方法相比，检测 gB蛋白编码DNA的qPCR灵敏度为94.6%，特异度为71.0% ；检测 gE蛋白编码DNA的qPCR灵敏度为94.6%，特异度为 79.3%，证明了qPCR是一种方便快捷有效的PRV检测方法。2013年，Pol等[12]使用Adiagène公司开发的商品化ADIAVET qPCR试剂盒检测多种临床样品，检测结果与病毒分离方法一致，证明了该方法具有良好的检测特异性和灵敏性，适用于临床样品的快速准确检验。

2 ELISA在PR检测方面应用进展

目前商品化ELISA试剂盒多通过检测gE蛋白或相关抗体，以区分疫苗免疫猪和野毒感染猪，通过检测gB蛋白抗体评价疫苗免疫效果。牛春玲等[13]统计了2004年之前ELISA在PR检测方面应用，系统介绍了直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA、斑点ELISA（dot-ELISA）、SPA-ELISA、双抗体夹心ELISA、单抗夹心ELISA等多种方法在PRV或其抗体检测方面的应用。目前对利用ELISA方法检测PR的研究仍在继续，主要集中于表达具有良好生物活性的PRV蛋白或肽段，来开发成本更低、特异性更高的ELISA试剂盒。在生产方面对提高ELISA试剂盒的稳定性、可重复性不良和减少假阳性的工作一直在进行中。

2003年Ao等[14]使用毕赤酵母表达的重组蛋白，制备了可以区分疫苗毒株免疫猪和野毒株感染猪的间接ELISA试剂盒，该试剂盒使用重组蛋白包被ELISA板以检测血清中的抗原，将 gE基因151～714位DNA序列克隆到毕赤酵母菌表达系统质粒中，获得了目的蛋白质，随后使用该蛋白包被ELISA板。使用该方法和IDEXX公司同类试剂盒检测了348份临床样品，统计发现两者的检测结果无显著差异。2004年倪健强等[15]采用大肠杆菌表达系统表达了gE蛋白抗原反应区，并且不含信号肽、胞内区和跨膜区的主要抗原表位区，获得了大小约为63 kD的重组可溶性蛋白，将其纯化为ELISA抗原，制备了具有良好特异性和敏感性的PRV ELISA鉴别诊断方法。使用该方法检测400份送检血清样品，结果分析表明，其检测结果与PRV全病毒制备的ELISA检测方法检测结果符合率95%以上，与基于抗gE 蛋白单抗竞争性ELISA检测方法检测结果的符合率为94%，表明此方法可用于区分PRV疫苗免疫猪和PRV野毒感染猪。2008年Gómez等[16]使用杆状病毒表达的重组蛋白制备了可以区分疫苗毒株免疫猪和野毒株感染猪的间接ELISA试剂盒，其具有成本低，特异性强的优点。其杆状病毒表达系统表达了经剪辑的PRV gE 基因，与野生型gE蛋白质相比，该重组蛋白去除了信号肽和跨膜域。使用该方法检测101份已知血清样品，检测结果与INGENASE和IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果无显著差异。2011年Serena 等[17]使用杆状病毒表达系统表达了包含蓝舌病NS1蛋白和PRV gE蛋白主要抗原肽段的重组蛋白，其中蓝舌病NS1蛋白能自我折叠形成具有良好免疫源性的螺旋结构并有助于重组蛋白纯化，PRV gE蛋白主要抗原肽段与 NS1蛋白C端连接并在排列于NS1蛋白螺旋结构表面形成了完整的空间构象并具有良好的生物学活性，使用该重组蛋白做为抗原包被ELISA板，成功制备了区分疫苗毒株免疫猪和野毒株感染猪的间接ELISA试剂盒。

3 小结

目前多种疾病在猪群中流行，多以混合感染为主，给猪病的检测带来了挑战。疫苗广泛的用于疾病的预防与控制，对用传统的血清学方法诊断猪病造成了严重干扰。PR给我国的猪养殖业造成了严重损失，PRV基因缺失疫苗被广泛应用于该病的预防，快速准确检测PR对该病的预防、治疗、控制和消灭具有重要的意义。与病毒分离、中和实验等方法相比，PCR和ELISA技术具有成本低、简便快捷、灵敏度高等优点，更适合PR快速检测和基层检测。随着技术的发展，PCR和ELISA检测灵敏度和准确度都得到了提高，还在向朝着降低生产和检测成本的方向发展，且PCR还实现了对多种疾病的同时检测。通过不断改进与完善，PCR和ELISA在PR及猪病检测方面将会发挥更大的作用。

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（责任编辑：孙荣钊）

Advances in PCR and ELISA Methods for the Detection of Porcine Pseudorabies

Wang Yanbin1，Zhao Lijun1，Shen Yanwei2
（1. Jiyuan Animal Health Supervision Institution，Jiyuan，Henan 459000；2. Economic And Technological Development Zone Branch Off i ce of Dezhou City Animal Products Quality and Safety Supervision Station，Dezhou，Shandong 253000）

Porcine pseudorabies （PR） is distributed world wide and causes great harms for pig farming industry. The fast，accurate，convenient and inexpensive diagnosis of the disease is of great signif i cance. PCR and ELISA methods have the advantages of simple operation，high sensitivity，simple result determination and low cost. They are widely used for the detection of PR in the fi eld. In this paper，the latest research for diagnosing porcine pseudorabies with PCR and ELISA methods were summarized，so as to provide reference in terms of quickly detection for PR.

porcine pseudorabies（PR）；detection；PCR；ELISA

S851.33

：A

：1005-944X（2017）06-0074-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.06.022