椎间盘髓核细胞修饰的相关研究进展

杨 斐，赵建宁，徐海栋 （南京军区南京总医院，江苏南京210002）

椎间盘髓核细胞修饰的相关研究进展

杨 斐，赵建宁，徐海栋 （南京军区南京总医院，江苏南京210002）

椎间盘退变性疾病是临床常见疾病，目前临床的治疗方法只能解除症状，无法从根本上治愈该病．髓核组织工程研究能够重建髓核组织，修复和逆转退变椎间盘．在组织工程研究中，同种异体的髓核细胞常被用作种子细胞，为了使种子细胞在移植后获得更高的活性，更长的存活时间以及更好的功能表达，要对髓核细胞进行一系列的修饰，主要包括：抗凋亡、调节自噬以及永生化修饰．抗凋亡和调节自噬的目的都是使种子细胞在移植后具有较高的活性，能够长期有效地行使功能，从而保证治疗的长期效果．永生化是为了解决髓核细胞传代次数有限，数量不足的问题．本文主要围绕以上三个方面展开综述．

椎间盘；髓核细胞；细胞修饰；凋亡；自噬；永生化

0 引言

椎间盘退变性疾病是临床较为常见的疾病，也是引起腰背部疼痛的主要原因［1］．椎间盘退变从20岁时就可以发生．不良的生活习惯、长期的大量载荷通过脊柱、应激、遗传以及抽烟等因素都与该病的发生发展密切相关［2－3］，其临床表现为颈部、胸部、腰背部的疼痛以及其对应神经支配区域出现的运动和感觉障碍．其最主要的病理变化为正常椎间盘组织结构的改变．正常的椎间盘组织是由三个部分组成的：终板、纤维环以及髓核．终板与椎体相连，被一层透明软骨覆盖，富含有毛细血管，为椎间盘提供营养物质．纤维环位于椎间盘外层，由多个薄层纤维组织排列组成，最外层为成纤维细胞和Ⅰ型胶原纤维，内层为类软骨细胞和Ⅱ型胶原纤维，纤维环具有较强的抗拉伸能力，具有维持椎间盘恒定高度的作用．髓核位于椎间盘中央，被纤维环包绕，呈凝胶状，含有髓核细胞，主要包括脊索细胞和类软骨细胞，其基质主要包括Ⅱ型胶原及蛋白聚糖等，具有较高的亲水性，能够保证髓核内部稳定的含水量、渗透压、pH以及离子浓度，维持正常代谢，同时承载部分椎间盘应力，维持椎间盘的形态和静水压力，协同纤维环共同实现生物学效应［4－5］．椎间盘退变发生的机制目前还不是很清楚，但是大部分学者认为髓核细胞退变和凋亡是该病的始动因素．在人体椎间盘发育过程中，椎间盘的血管网逐渐消失，脊索细胞逐渐减少，至成人时已无脊索细胞，主要的髓核细胞为类软骨细胞，它具有合成细胞外基质蛋白聚糖以及Ⅱ型胶原的作用，而细胞外基质蛋白对维持椎间盘正常生理功能至关重要．正常的椎间盘不含有血管，为低氧环境．髓核细胞所需的营养物质、氧以及产生的代谢产物主要通过扩散作用进出髓核．随着长期的应力刺激和低氧状态下的代谢异常蓄积，髓核细胞开始出现凋亡、自噬等一系列变化，细胞活性降低，细胞外基质合成功能减退，细胞外基质代谢异常又进一步影响营养物质和氧代谢，加剧髓核细胞外环境酸化，形成恶性循环．最终出现纤维环胶原纤维薄层结构紊乱、裂隙生成，椎间盘生物力学功能丧失，相应的临床症状也逐步出现［6］．

目前对于椎间盘退变性疾病的临床治疗可大致分为保守治疗及手术治疗．非手术治疗主要是通过休息或者药物治疗缓解局部炎症刺激，而手术治疗中无论是脊柱融合手术还是非融合手术，也主要是为了缓解临床症状，而非根本性的治疗［7］．针对该病的始动因素，逆转髓核细胞凋亡以及自噬，促进髓核细胞活性以及其功能表达成为根治椎间盘退变性疾病的主要方向．现阶段较多的组织工程研究将同种异体髓核细胞作为种子细胞用于研究治疗椎间盘退变性疾病，在研究中往往需要对髓核细胞进行一系列修饰，以使其获得更高的活性，更长的存活时间以及更好的功能表达［8］．修饰的主要方向大致可以分为三类：抗凋亡、调节自噬以及永生化修饰．本文通过对髓核细胞的抗凋亡、调节自噬以及永生化修饰等三方面进行综述，旨在探讨：①不同修饰方法所基于的具体机制是否合理；②运用于临床的可能性；③其临床治疗的真正价值．

1 髓核细胞抗凋亡修饰

髓核细胞移植成功的关键在于其抗凋亡能力，即如何保证在已经出现椎间盘退变的宿主体内实现大量移植髓核细胞的长期存活，并实现其功能表达．早期的研究着重于提高髓核细胞的抗凋亡能力．髓核细胞移植后，在已经发生退变的椎间盘中，移植受体细胞产生的NO、过氧化物、自由基等因素均可诱发内质网应激反应（ERS），进而导致髓核细胞出现凋亡［9］．真核细胞的大多数功能蛋白一般需转位至内质网腔内进行修饰和折叠．氧化应激、缺血、钙稳态的失衡等诸多因素均可影响内质网的功能，导致未折叠或错误折叠蛋白的积累，这一过程即称之为ERS［10］．ERS又可进一步激活未折叠蛋白反应（UPR），早期表现为蛋白质翻译和转运的抑制，促进分子伴侣的表达，诱导内质网相关性降解（ERAD），维持ER的正常功能．当长期持续的应激或刺激强度超过内质网自身处理能力时，UPR便会启动细胞凋亡信号，导致细胞凋亡的发生［11］，其中，X盒结合蛋白1（X⁃box binding protein 1，XBP1）是ERS反应的关键信号调控因子，XBP1 mRNA经过需肌醇酶1（inositol⁃requiring kinase 1，IRE1）的剪接，由原本具有261个氨基酸的未剪接型 XBP1（X⁃box binding protein⁃1 unsplicing，XBP1u）转录激活成为由376个氨基酸构成的剪接型XBP1（X⁃box binding protein⁃1 splicing，XBP1s）．XBP1s可调控内质网相关蛋白的降解和分子伴侣的合成，促进髓核细胞的生存［12］．其具体机制目前尚未完全阐明，需要更多研究来揭示XBP1在保护椎间盘髓核细胞抗凋亡过程中作用的分子机制及相关信号通路．

SOX9基因属于SOX基因大家族成员之一，是软骨细胞合成Ⅱ型胶原过程中重要的因子．在椎间盘退变过程中出现Ⅱ型胶原的减少，其过程与SOX9基因的表达减少有关［13］．有学者通过脂质体将SOX9基因和GDF5基因同时转染到骨髓间充质干细胞，发现显著提高了骨髓间充质干细胞向髓核细胞分化增殖的能力，同时，髓核细胞获得了较高的活性和抗凋亡能力［14］．将慢病毒作为载体转染SOX9基因的骨髓间充质干细胞同样也能高度表达Ⅱ型胶原以及蛋白聚糖并向髓核样细胞分化，这些实验充分说明了经过SOX9基因修饰的髓核类细胞具有更完整的细胞表型，更优秀的蛋白合成能力以及更良好的抗凋亡活性，可进一步用于椎间盘组织工程的研究当中．

PcG蛋白是一种通过染色质修饰调控靶基因的转录抑制子的蛋白，具有细胞记忆功能，可以保证细胞传代的稳定．CBX8为PcG蛋白的核心组成部分，能够通过相关结合位点以及信号通路如INK4A⁃ARF通路来调整细胞的增殖，延缓细胞的衰老［15］．同时，也有报道称CBX8参与了细胞DNA损伤的修复［16］．为了研究CBX8对椎间盘髓核退变的相关作用机制，国内有学者干扰髓核细胞CBX8表达后发现髓核细胞增殖能力减弱，细胞周期进程减慢，慧尾实验证实当CBX8表达降低后，髓核细胞的DNA修复能力将会受到抑制．相反，调高CBX8表达后髓核细胞活性升高，增殖相对活跃，多次传代培养后表型保持相对完整，可作为髓核组织工程种子细胞的选择［17］．

在椎间盘退变过程中，TGF⁃β1在早期能够促进髓核细胞外基质的生成，减慢退变发生的速度，然而随着成纤维细胞不断增多取代髓核细胞，在TGF⁃β1作用下合成Ⅰ型以及Ⅲ型胶原，Ⅱ型胶原合成减少，髓核生理结构破坏，退变加速，最终导致整个椎间盘纤维环失去原有力学性质［18］．TGF⁃β3在TGF⁃β家族中属于正向调节因子，在降低TGF⁃β1表达的同时能够促进Ⅱ型胶原的合成［19］．腺病毒载体技术能够将TGF⁃β3转染至退变的髓核细胞，体外实验发现细胞活性得到明显改善，Ⅱ型胶原及蛋白聚糖表达升高，在进一步的动物实验中，TGF⁃β3转染修饰的髓核细胞被移植到新西兰兔退变动物模型中，14周后组织学观察发现缺损的椎间盘部分得到新生髓核的填充，髓核细胞数目增多，Ⅱ型胶原和蛋白聚糖增多，并且使用该种方法转染的髓核细胞，其目的基因可保持稳定表达的时间长达3个月，可以有效运用于组织工程研究［20］．

2 髓核细胞自噬调节

凋亡和自噬是细胞程序性死亡的两种形式．继抗凋亡研究之后，后续的研究发现自噬对调节髓核细胞程序性死亡也同样重要．与凋亡相比，自噬不出现凋亡所特有的凋亡小体以及核固缩现象，但会在细胞胞质内形成自噬体．在正常情况下，自噬对细胞是有利的，能够促进细胞在应激状态下的存活，清除细胞内由应激产生的氧自由基、错误折叠蛋白等．但是过度自噬将会超出细胞的代偿能力，溶酶体将无法降解全部自噬体，由此诱发细胞Ⅱ型程序性死亡或者触发细胞凋亡最终导致细胞死亡［21］髓核细胞处在缺血、缺氧的椎间盘环境中，同样也存在着自噬现象，而且其水平会随着年龄的增长以及退变程度的加重而不断地提高［22］．有研究发现自噬对于髓核细胞有两方面的作用：一方面在正常椎间盘组织中，自噬能够保证髓核细胞在低血供、低氧状态下的稳定，而发生重度椎间盘退变的动物模型中，其自噬水平要明显低于正常，相反凋亡水平明显升高．另一方面，在椎间盘退变早期，由于代偿作用使自噬水平明显升高，超过溶酶体代偿能力，过度自噬导致了髓核细胞的死亡［23］．因此，针对组织工程中髓核细胞自噬水平的调控应该以维持其平衡为目标，既要保证一定的自噬水平以维持细胞的稳定，同时又要避免自噬过度对细胞产生损伤．目前髓核细胞自噬水平的调节机制还不清楚，有研究［24］发现在通过血清剥夺诱导SD大鼠椎间盘细胞发生自噬后，IL⁃1β能促进其自噬水平进一步的升高．椎间盘本身存在的低氧环境对自噬也具有重要的调节作用，髓核细胞在低氧环境中能够通过下调ROS来避免过度自噬，促进其在血清剥离下的存活［25］．因此，在髓核组织工程构建中，应尽可能保证髓核细胞处于相对低氧环境．

3 椎间盘髓核细胞永生化

目前，随着基因转染技术的不断发展，髓核细胞永生化的构建成为了新的研究方向．正常细胞在体外经过有限次数的传代后便会衰老死亡，髓核细胞在体外培养传代时间平均为21 d，经过10次左右传代后便停止增殖．在组织工程研究中，为了获得更多的髓核细胞资源，往往会对种子细胞进行永生化修饰．细胞永生化是指细胞在一定条件干预下逃离增殖衰老危机，获得无限增殖能力的过程，但人类细胞很少会出现自发永生化［26］．研究中，可以将永生化基因通过基因转染技术导入髓核细胞，建立永生化髓核细胞株，从而获得丰富的种子细胞来源．现阶段研究发现，永生化的发生主要与细胞端粒以及端粒酶有关．因此，针对髓核细胞永生化的修饰，主要是通过修饰端粒以及端粒酶来完成．端粒的长度决定了细胞的有丝分裂次数，而端粒酶能够维持端粒长度的恒定［27］．因此，通过活化端粒酶，提高其表达可以诱导髓核细胞发生永生化．有学者运用人端粒酶反转录酶转染髓核细胞，成功地构建了永生化髓核细胞，并且在构建的永生化髓核细胞中加入重组绿色荧光蛋白示踪，具有较高的转染效率，同时永生化髓核细胞的表型及活性在多次传代后能够保持稳定，该技术能够为髓核组织工程的研究提供丰富的种子细胞［28］．

髓核细胞修饰的发展大致经历了抗凋亡、自噬调节以及目前的永生化这一系列过程．三者之间也存在着紧密联系．①三类修饰方法中抗凋亡修饰最早出现，也是基础，自噬调节是对抗凋亡修饰的补充，永生化研究则是目前的新的研究方向；②三者的目的都是为了提高髓核细胞在移植后的细胞活性；③三者基于不同的机制，存在各自的优点和缺陷，联合运用相关方法或许能够达到更好的效果．

4 总结与展望

髓核组织工程研究对于治疗椎间盘退变性疾病是一种新的思路，能够从根本上修复甚至逆转退变过程．它主要包含三个要素：种子细胞，细胞支架以及生长因子．其中，种子细胞是整个组织工程研究中最重要的对象，如何能够获得大量表型稳定，功能和活性良好的种子细胞一直是组织工程研究的问题．同种异体的髓核细胞因为其不需要诱导分化，适应低氧环境等优点被用作种子细胞，为了保证移植后的活性和功能，髓核细胞需要进一步修饰．抗凋亡和调节自噬的目的都是使种子细胞在移植后具有较高的存活率，能够长期有效地行使功能，从而保证治疗的长期效果．永生化则是为了解决髓核细胞传代次数有限，数量不足的问题，组织工程治疗椎间盘退变需要运用大量种子细胞，只有在保证充足的髓核细胞数量前提下，才能实现进一步的研究和治疗．在解决了以上问题后，髓核组织工程治疗椎间盘退变性疾病才能最终实现临床运用．

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Advances in research of nucleus pulposus cell modification in intervertebral discs

YANG Fei，ZHAO Jian⁃Ning，XU Hai⁃Dong
Nanjing General Hospital of PLA，Nanjing 210002，China

Degenerative disc disease is a common clinical dis⁃ease．The current clinical treatment can only relieve symptoms．However，nucleus pulposus tissue engineering can reconstruct the nucleus pulposus，repair and reverse degenerative disc．In tissue engineering studies，allogeneic nucleus pulposus cells are often used as seed cells．In order to make seed cells obtain higher viability，longer survival time and better functional expression after transplantation，a series of modifications have to be applied to nucleus pulposus cells，including：anti⁃apoptosis，regulation of autophagy and cellular immortality．The purpose of anti⁃apoptosis and autophagy regulation is to make seed cells have high viability after transplantation，and to ensure the long⁃term effect of treat⁃ment．Cellular immortality can solve the problem of limited pas⁃sage number and insufficient cell resources．This article mainly focuses on the above three aspects．

intervertebral disc；nucleus pulposus cells；cell modification；apoptosis；autophagy；immortalization

R681．5

A

2095⁃6894（2017）02⁃53⁃04

2016－12－27；接受日期：2017－01－12

国家自然科学基金青年基金项目（81501925）

杨 斐．E⁃mail：1415619503＠qq．com

徐海栋．博士，副主任医师．研究方向：脊柱外科、骨科基础与转化．E⁃mail：xuhaidong1980＠163．com