坏死性凋亡调节机制及其分子靶向药物相关研究进展

陈俞乐

坏死性凋亡调节机制及其分子靶向药物相关研究进展

陈俞乐

坏死性凋亡；调节机制；细胞死亡；靶向药物

坏死性凋亡是一种不依赖于cappase激活的细胞程序性死亡过程，在肿瘤、神经系统退行性病变、缺血性损伤以及病毒感染的发生、发展、治疗以及预后中起着重要的作用。坏死性凋亡的诱导过程中最重要的一部分为caspase-8激酶的抑制以及RIP1与RIP3形成ComplexⅡb，然后由necrosome向下游传达信号最终执行坏死性凋亡程序。坏死性凋亡的特异性阻断剂Nec-1正是通过阻断RIP1和RIP3的磷酸化，阻止ComplexⅡb的合成，进而阻断坏死性凋亡信号通路的。

1 坏死性凋亡与凋亡

1.1 坏死性凋亡的概念长时间以来，人们一直以为细胞的程序性死亡就是指代细胞凋亡，并一直认为细胞凋亡的激活由半胱氨酸蛋白酶家族（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspases）调控。但随着人们对细胞凋亡信号通路的研究越来越深入，人们发现当抑制Caspases后，细胞的程序性死亡并不能得到完全的抑制。并且这种未能被抑制的细胞死亡后的表现形式与凋亡有较大的差异性，一部分的表现具有相当的坏死样形态学特征。这就说明在细胞的程序性死亡过程中，Caspases的激活并不是唯一能诱导细胞程序性死亡的方式，很有可能存在其他的通路也能引起细胞的程序性死亡。在2005年，Degterev等[1]就报道了一种未被提出过的细胞死亡方式并命名为坏死性凋亡（necroptosis）。他们将其定义为：一种细胞死亡后的形态学特征与坏死相近，但其启动方式为非caspase依赖的具有可调控性的程序性细胞死亡。即在抑制caspase的条件下，配体与相应的死亡受体结合后可启动坏死性凋亡。

1.2 坏死性凋亡与坏死、凋亡的区别细胞的死亡是一个复杂的过程，人们依据其过程是否可被调控将细胞死亡方式分为两大类：凋亡及坏死。不论是可调控的程序性凋亡还是外力作用下不可控的被动坏死，其发生均需要激活、表达一系列特定的分子来进行调控。而近年来提出的坏死性凋亡是一种新的细胞死亡方式，它的发现加深了人们对细胞死亡过程的认识。

坏死是由于外力导致的物理性创伤致使细胞内环境渗透压的平衡的改变，导致细胞发生不可逆转的死亡。在这种方式下死亡细胞的表现有：细胞膜完整性消失，渗透压改变致使细胞膜肿胀破裂，线粒体功能发生改变等。除了细胞本身的变化外，周围组织产生炎症反应也是细胞坏死常伴随的现象，因为存在细胞膜破裂后，胞内成分迅速、大量漏出的情况。

凋亡是细胞的一种自我杀伤现象，当细胞遇到外界刺激后，这些无法再完成其本身作用或受到损害的细胞会在基因调控下，由caspase诱导启动程序性的细胞自我毁灭。当细胞发生凋亡时，主要表现为DNA的溶解断裂、染色质聚集，继而细胞核裂解、细胞膜内陷形成凋亡小体，从而避免了因胞内成分外漏而导致的炎症反应。细胞凋亡主要包括两条信号通路，分别为：由细胞膜上的死亡受体DR（deathreceptor）介导的外源性通路和由线粒体释放细胞色素C启动的内源性通路。caspase的活化及其级联反应在这两条通路的激活中都是必不可少的[2-3]。

坏死性凋亡也是一种由程序性控制的细胞死亡方式，但与凋亡不同的是，被人们所熟知的导致细胞凋亡的重要调节因子caspase并不能诱导坏死性凋亡的启动[4]。除此之外，坏死性凋亡还有着一些所独有的表现[5]：坏死性凋亡的细胞呈现坏死样形态学特点，细胞膜失去完整性，下游应答多表现为自噬，细胞内活性氧升高不是细胞死亡的关键因素，通过小分子Nec-1可以特异性的抑制坏死性凋亡的发生。

1.3 坏死性凋亡与凋亡的联系坏死性凋亡和凋亡虽然诱导起发生的相关信号通路有所区分，细胞死亡后的形态表现也不尽相同，但两者之间在一定程度上仍然有所联系。上世纪90年代起的多项实验结果均展示出了这一点。具体表现有当人为的将诱导凋亡的信号通路进行抑制后，这些死亡受体仍能诱导细胞死亡，但最终的表现为坏死性凋亡而非凋亡，如对于由TNF-α、FasL引起凋亡的细胞，使用caspase抑制剂或将caspase-8敲除后，两者将诱导细胞的坏死，而不再引起凋亡。而2009年由Han等[5]完成的一项实验则表明，在Nec-1的作用下，紫草素诱导细胞产生坏死性凋亡的作用将被抑制，但此时细胞转而启动凋亡进行自我毁灭。近年来的各项研究均提示我们，坏死性凋亡和凋亡的信号通路有着重合的部分，有很大可能互相关联并通过特定的抑制剂来进行两者间的转化。

2 坏死性凋亡调节机制

细胞的程序性死亡是一个主动、复杂和动态的过程，其中涉及到一系列特定因子及受体的表达、激活和调控。随着坏死性凋亡概念的提出以及相关技术的提高，有关坏死性凋亡机制的研究逐年增多。就当前的研究来看，有两条信号通路被了解得相对透彻，分别为TNFα（tumor necrosis factor）及TNF-R1（tumor necrosis factorreceptor 1）相关信号通路以及TRAIL（necrosisfactorligandsuperfamilymember 10）及Fas L（tumornecrosis factor ligand superfamily m-ember 6）相关信号通路。

2.1 TNF-α及TNF-R1相关信号通路肿瘤坏死因子α（TNF-α）及肿瘤坏死因子受体1（TNF-R1）相关信号通路的诱导主要过程为[6－11]：TNF-α与TNFR1相结合，诱导自身及下游TRADD（TNFαreceptorassociated death domain protein）和RIP1（receptorinteracting protein kinase 1）激酶以及其他分子聚集形成膜相关复合物Ⅰ（Complex I）。随后ComplexⅠ通过内吞将TRADD及RIP1从自身分离出去，同时与FADD（fas-associated death domainprotein），caspase-8及RIP3（receptor-interactingprotein kinase 3）激酶结合，形成ComplexⅡa。在ComplexⅡa内，如caspase-8活化，则切割破坏RIP1及RIP3，在关闭necroptosis通路的同时激活外源性凋亡通路，最终导致细胞凋亡。如果此时我们对caspase-8的活性进行抑制，使之功能出现障碍，则它不能完全清除RIP1以及RIP3。此时RIP1和RIP3通过磷酸化形成ComplexⅡb（亦称necrosome），构型发生变化，结合更加紧密。而后ComplexⅡb将信号向下游传递，最终诱导坏死性凋亡的发生。因此，的激活与否及RIP1和RIP3之间的相互作用可以称为是最终激活凋亡或坏死性凋亡的“切换开关”。坏死性凋亡的特异性阻断剂Nec-1正是通过阻断RIP1和RIP3的磷酸化，阻止ComplexⅡb的合成，进而阻断坏死性凋亡信号通路的[6，9]。

2.2 TRAIL及Fas L介导的信号通路TRAIL及F-as L相关信号通路中ComplexⅠ的组成部分与TNFα及TNF-R1相关信号通路有区别，相比之下增加了Fas L、TRAIL、TRAF2（tumor necrosis factor recepto-rassociated factor 2）及FADD。其中TRAIL和Fas L受体因为缺少DD部分所以需要通过FADD辅助从而与TNF-R1相结合[12-13]。所以，在TRAIL及Fas L介导的信号通路中FADD是必不可少的一部分[7]。随后形成组成与TNFα及TNF-R1相关信号通路相似的ComplexⅡ进一步向下游传导信号。除此之外precaspase-8以及cFLIP（cellular FLICE-inhibitoryprotein）可通过FADD与Complex域a结合，根据两者竞争性结合的结果，细胞将呈现出凋亡及坏死性凋亡两种程序性死亡方式。

3 作为新型靶向药物可行性研究

3.1 可作为新型靶向药物的理由近年研究发现，坏死性凋亡与恶性肿瘤的发生、发展、治疗及预后有着密切的联系。另外与其他具有坏死表型的疾病如神经系统退行性病变、缺血性损伤以及病毒感染等也有着一定的联系。另外，许多针对坏死性凋亡调节机制所做的研究结果均显示：坏死性凋亡也是一种可通过一系列因子的活性化及高表达来进行调控的细胞程序性死亡，其中RIP1、RIP3及caspase家族的作用最为明显。目前有不少研究证明，caspase家族活性是否被抑制及RIP1和RIP3之间的相互作用是最终激活凋亡或坏死性凋亡的重要原因。

3.2 现有的理论、实验成果近几年研究发现，许多化合物质以及抗癌药物能够从各种途径引发肿瘤细胞产生坏死性凋亡，从而杀伤肿瘤细胞，其中也包括一些天然药物。其中最早报道由小分子复合物诱导的坏死性凋亡可规避肿瘤多药耐药性的是胡讯等关于坏死性凋亡诱导剂——紫草素的研究[14]。在他们的研究中，紫草素及其类似物所诱导发生的坏死性凋亡对于躲避肿瘤耐药性具有普遍性，其表现在能够有效避免MRP1、BCRP1及P-gp等多种药泵造成的多药耐药。另外有研究发现MCF-7、HEK 293这类抗凋亡诱导剂蛋白高表达的细胞株对紫草素的坏死性凋亡作用仍然敏感。这表明，紫草素可以躲避肿瘤细胞对凋亡所产生的抵抗性，通过necroptosis途径而发挥杀伤细胞作用。实验发现，通过给骨肉瘤肺转移动物模型注射紫草素，最终表现出了原发肿瘤及肺转移灶的肿瘤细胞生长得到抑制，模型动物的生存率得到提高[15]。

4 结语

对坏死性凋亡信号通路的诱导及阻断机制进行研究，有助于寻找相关疾病新的治疗靶点及为新的分子靶向药物的研发做出贡献。其中坏死性凋亡对回避肿瘤的多药耐药性及凋亡耐药有着较为明显的功效，对开辟新的肿瘤靶点治疗思路，开发新型分子靶向药物有着很大的指导意义。

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（收稿：2016-10-21 修回：2016-11-20）

浙江中医药大学第一临床医学院（杭州310002）