HPLC 法测定新疆软紫草属4 种植物根中萘醌类成分

丁文欢， 燕雪花， 葛 亮， 徐海燕∗

（1. 新疆医科大学中心实验室， 新疆 乌鲁木齐 830054； 2. 新疆医科大学中医学院， 新疆 乌鲁木齐 830054）

《中国药典》 中紫草来源于紫草科软紫草属植物新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst.、 黄花软紫草Arnebia guttata Bunge 的干燥根[1］， 为新疆道地药材， 被誉为“凉血之圣药”[2］， 主要活性成分为萘醌色素类——紫草素及其衍生物， 其含有量对于考量药材品质而言尤为重要， 这类物质主要有抗炎、 抗菌、 抗病毒、 抗癌、 保护肾脏、 抑制细胞色素等作用[3-11］， 测定方法包括分光光度法、 薄层扫描法、 高效液相色谱法、 电化学法[12-21］。 受药材来源、传统民族医药药用习俗等影响， 紫草在市场上出现鱼目混杂的现象， 市售紫草无论源自新疆或国外， 其正品均源于软紫草属， 该属共约25 种， 分布在新疆的有新疆紫草A．euchroma、 黄花软紫草A． guttata、 天山软紫草A． tschimganica、 硬萼软紫草A． decumbens、 紫筒花A． obovata[22］， 天山软紫草、 硬萼软紫草虽未被《中国药典》 收录， 但其性状特征显示， 2 种植物的根分别与新疆紫草、 黄花软紫草相似， 均呈现紫红色， 推测可能含有紫草素， 但未见有关其具体成分及含有量的报道。 本研究测定了新疆紫草、 黄花软紫草、 天山软紫草、 硬萼软紫草4 种植物根中7 种萘醌类成分的含有量， 为扩大该植物新药源提供了参考。

1 材料

1.1 仪器 MS105DU 型电子天平（十万分之一， 瑞士梅特勒-托利多公司）； KQ5200DE 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）； 安捷伦1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）。

1.2 试药 β， β′-二甲基丙烯酰紫草素（15102821）、 左旋紫草素（15102721）、 去氧紫草素（15062422）、 乙酰紫草素（15120431） 对照品由上海同田生物技术有限公司提供； β-乙酰氧基异戊酰紫草素（P05M7F14235） 由上海源叶生物技术有限公司提供； 异丁酰紫草素（wkq16101302）由四川省维克奇生物科技有限公司提供； 2-甲基丁基酰紫草素（AV51-LDQR） 由日本化成工业株式会社提供。 乙腈、 甲酸为色谱纯； 石油醚（60～90 ℃） 为分析纯； 水为艾科超纯水。

1.3 样品 药材采自新疆， 由新疆医科大学中药资源教研室徐海燕副教授鉴定为紫草科软紫草属新疆紫草Arnebiaeuchroma （采自霍城）； 黄花软紫草Arnebia guttata （采自阿图什）； 天山软紫草Arnebia tschimganica （采自和静）； 硬萼软紫草Arnebia decumbens （采自昌吉） 的干燥根， 粉碎过4 号筛， 备用。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备 分别取左旋紫草素、 乙酰紫草素、β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、 去氧紫草素、 异丁酰紫草素、β， β′-二甲基丙烯酰阿卡宁、 2-甲基丁基酰紫草素对照品2、 10、 10、 1、 10、 5、 25 mg， 置25 mL 量瓶中， 乙腈定容， 得贮备液。 分别取除2-甲基丁基酰紫草素外其余6 种贮备液适量， 置同一10 mL 量瓶中； 取2-甲基丁基酰紫草素贮备液3.5 mL， 置10 mL 量瓶中， 即得。

2.2 供试品溶液制备 取药材粉末约1.0 g， 精密称定，置锥形瓶中， 加入石油醚（60～90 ℃） 50 mL， 称定质量，超声30 min， 冷却， 石油醚（60 ～90 ℃） 补足减失质量，过滤； 量取续滤液（新疆紫草10 mL， 黄花软紫草、 天山软紫草、 硬萼软紫草各30 mL）， 蒸干， 残渣加乙腈溶解，转移至10 mL 量瓶中， 乙腈定容至刻度， 摇匀， 即得。 色谱图见图1。

图1 各成分HPLC 色谱图

2.3 色 谱 条 件[1，23］Agilent-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）， 流动相乙腈-0.05% 甲酸 （70 ∶30）； 体积流量1 mL／min； 检测波长275 nm； 柱温30 ℃； 进样量10 μL。

2.4 线性关系考察 精密吸取除2-甲基丁基酰紫草素外其余6 种贮备液适量， 置5 个10 mL 量瓶中， 乙腈定容并混匀； 精密吸取2-甲基丁基酰紫草素贮备液0.1、 2.0、 4.0、6.0、 8.0 mL， 置5 个10 mL 量瓶中， 乙腈定容并混匀。 分别吸取各质量浓度对照品溶液， 在“2.3” 项色谱条件下测定， 以峰面积为纵坐标（Y）， 质量浓度为横坐标（X） 进行回归， 结果见表1， 可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.5 精密度试验 取供试品溶液， 在“2.3” 项色谱条件下连续进样6 次， 测得7 种萘醌类成分峰面积RSD 分别为0.35%、 0.22%、 0.53%， 1.70%、 0.28%、 0.45%、0.24%， 表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取供试品溶液， 在“2.3” 项色谱条件下于0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 24 h 测定， 测得7 种萘醌类成分峰面积RSD 分别为1.52%、 0.45%、 1.27%、 1.84%、0.70%、 1.12%、 0.48%， 表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.7 重复性试验 取药材粉末6 份， 精密称定， 按“2.2”项下方法制备供试品溶液， 在“2.3” 项色谱条件下测定，测得7 种萘醌类成分含有量RSD 分别为1.67%、 1.99%、1.84%、 1.02%、 2.05%、 1.92%、 2.07%， 表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验 以乙腈为溶剂配制图1 中1 ～6 成分的对照品溶液， 质量浓度分别为0.161、 3.040、 1.332、0.160、 1.761、 1.034 mg／mL。 取 药 材 粉 末12 份， 每 份0.25 g， 精密称定并置锥形瓶中， 其中6 份分别加入以上对照品溶液1.0 mL， 另外6 份分别精密加入4.000 mg／mL 2-甲基丁基酰紫草素对照品溶液1.0 mL， 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.3” 项色谱条件下测定， 测得回收率 （RSD） 分别为99.75% （0.42%）、 99.17%（0.92%）、 99.12%（0.71%）、 98.63% （1.94%）、 97.37%（1.64%）、 99.07% （0.70%）、 98.37% （1.08%）。

2.9 样品含有量测定 取4 种样品各3 份， 按“2.2” 项下方法制备供试品溶液， 在“2.3” 项色谱条件下测定，计算含有量， 结果见表2。

表2 各成分含有量测定结果（mg／g）

4 种软紫草属植物根中均含有萘醌类成分， 不同种间存在差异。 在“2.3” 项色谱条件下， 新疆紫草的萘醌类成分总量最高， 为46.745 5 mg／g， 其次是黄花软紫草， 含有量最低的为硬萼软紫草， 为17.331 4 mg／g， 推测可能是硬萼软紫草为一年生草本植物， 其余几种均为多年生草本植物， 各成分在植物体内的蓄积不同。 新疆紫草、 黄花软紫草均含有7 种成分， 天山软紫草检测到除去氧紫草素外的6 种成分， 硬萼软紫草未检测到β-乙酰氧基异戊酰阿卡宁、 β， β′-二甲基丙烯酰阿卡宁。 2015 年版《中国药典》规定， 紫草中含β， β′-二甲基丙烯酰阿卡宁不得少于0.30%， 本研究发现新疆紫草、 黄花软紫草及天山软紫草中该成分均符合药典规定。 7 种萘醌类成分中， 各基源软紫草中分布情况不同， 可作为药典收录品种与其他非收录品种间的鉴别依据。

3 讨论

因2-甲基丁基酰紫草素含有量仅为88.0%， 从色谱图中可以看出它会对其他6 种待测成分产生干扰， 故本研究中该成分的线性关系考察、 加样回收率试验均单独进行。

本研究采用HPLC 法同时测定4 种软紫草属植物根中7种成分含有量， 方法简单快速， 重复性好， 结果稳定可靠。《中国药典》 仅对β， β′-二甲基丙烯酰阿卡宁进行定量分析， 而本研究同时测定7 种萘醌类成分， 可提高药材质量标准， 能用于紫草及同属其他植物的鉴别及质量评价。

然而， 本实验每种紫草仅测定了一批样品， 对几种紫草中各成分含有量的高低尚不能得出定论。 若要比较其差异， 则需要扩大样本量， 考察不同生长期、 生长环境的影响， 以期为紫草质量控制及扩大新药源提供参考依据。