蕲蛇乙醇提取物多肽成分的蛋白组学研究

林晨 温成平 范永升

·实验研究·

蕲蛇乙醇提取物多肽成分的蛋白组学研究

林晨 温成平 范永升

目的通过蛋白质组学方法分析蕲蛇乙醇提取物中的多肽类成分。方法双向凝胶电泳技术分离多肽，染色后切取多肽斑点胶内酶切，利用基质辅助激光解吸离子飞行时间串联质谱（MALDI-TOF-MS/MS）分析酶切后抽提的肽段，获取的质谱数据进一步用于数据库检索，鉴定相关肽段序列。结果采用稀乙醇热浸法每克蕲蛇药材多肽溶出率为5.48%。凝胶图像显示各等电点区间均有2kDa的多肽分布，无法通过串联质谱数据结合数据库检索方式有效鉴定，而在15kDa区间存在的胶点中高置信度匹配到多个肽段。结论采用稀乙醇热浸法能有效提取蕲蛇干燥药材中的多肽成分。

蕲蛇；多肽；蛋白质组学；凝胶电泳；质谱鉴定

中药蕲蛇为蝰科动物五步蛇Agkistrodon acutus（Guenther）的干燥体，具有祛风散寒，舒筋活络的功效，《景岳全书》称颂其“风毒恶疮，俱为要药”[1]。近年研究表明，蕲蛇含有核苷类[2]和磷脂类[3]成分，但对这些成分的生物活性并无相关报道。另一方面，蕲蛇属于动物药，以干燥蛇体入药，富含蛋白质，药材中总氨基酸含量接近70%[4]，但一直以来对这类成分的研究较少。刘训红等[5]早期研究从蕲蛇提取物中测得一类分子量未知的酸性蛋白，丁兴红等[2]通过生物酶解方法从蕲蛇中提取出130kDa的Ⅱ型胶原蛋白，具有炎症抑制活性[6-7]。最近，柴士伟等[8]以蕲蛇药材中四种氨基酸总含量为指标来优化汤剂的煎煮工艺。但目前对传统的酒浸、煎煮提取方法中获取的肽类成分的表征及其活性尚无相关研究报道。

基于生物质谱技术的蛋白质组学研究相比传统的蛋白质鉴定方法（如免疫学或氨基酸末端测序），简化了蛋白纯化流程，能够高通量、高灵敏度分析复杂样品，在中药复杂体系作用机制的分析中得到广泛应用。目前生物质谱的蛋白质鉴定可分为自上而下（top-down）以及自下而上（bottom-up）的两种策略，top-down策略由于数据库搜索算法的局限性和较高的假阳性率，使其在蛋白质鉴定的质量控制方面的问题十分突出，bottom-up策略将蛋白质酶解成肽段再进行分析，带电量较低，能够获得更小的分析物相对分子质量，有利于提高质谱检测的灵敏度[9]。本研究基于凝胶电泳的top-down策略研究蕲蛇乙醇提取物中的多肽成分，通过双向凝胶电泳以及MALDI-TOF-TOF MS串联质谱分析，有效分离和识别溶出的多肽，为进一步探讨蕲蛇肽类成分的功能活性及药效提供依据。

1 材料

1.1 仪器KTA purifier 100蛋白纯化系统（美国GE公司）；Scientific Appliskan酶标仪（ThermoFisher公司）；PROEAN IEF等电点聚焦仪（美国Bio-Rad公司）；PROTEANⅡxi垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司）；5800 MALDI-TOF/TOFтм串联质谱仪（美国AB SCIEX公司）；ALPHA 1-2 LD plus冷冻干燥机（德国Christ公司）；默克密理博Synergy超纯水仪（德国Merck公司）；ST 8R离心机（ThermoFisher公司）；BS423S分析天平（sartorius公司）；DZG-6020真空烘箱（杭州卓驰仪器有限公司）。

1.2 试剂无水乙醇（杭州龙山精细化工有限公司，批号20140114），氯化钠（上海试四赫维化工有限公司，批号20150710）均为市售分析纯。四甲基乙二胺（TEMED），过硫酸铵（AP），1.5M Tris二硫苏糖醇（DTT），碘乙酰胺（IAA），11cm非线性IPG胶条，pH3-10两性电解液，30%丙烯酰胺预混溶液，precision plus蛋白mark（货号161-0377）均购自美国Bio-Rad公司；5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（货号P0015，上海碧云天生物技术研究所），考马斯亮蓝G-250（货号北京索莱宝科技有限公司），溴酚蓝（美国sig-ma公司），1×PBS磷酸盐缓冲液（杭州吉诺生物医药技术有限公司），BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。

1.3 供试药材蕲蛇药材由浙江中医药大学中药饮片有限公司提供，粉碎过80目筛备用。

2 方法

2.1 溶出率测定参照2010版《中国药典》Ⅰ部附录ⅩA：浸出物测定法下的热浸法[10]所述，称取药材粉末25.024g，烘干30min，加入10倍量50%稀乙醇，密闭回流提取，溶液沸腾后保持微沸1h后室温冷却，收集溶液，5000×g离心20min，弃去底部药渣沉淀，收集上清液，0.45μm超滤膜滤过。吸取10μL提取液，BCA法测定中多肽浓度，按照试剂盒说明操作。重复3次取均值，计算提取液中多肽成分的含量和溶出率。

2.2 样品处理提取液-20℃静置过夜，待絮状沉淀完全析出，5000×g离心30min，弃去上清，收集沉淀，-56℃冻干后保存。

取出冻干样品，加入20mmol/L PBS磷酸缓冲液10mL完全复溶，BCA法测定溶液中多肽的浓度。

2.3 双向凝胶电泳参照文献[11]进行双向凝胶电泳分析。等点聚焦用11cm IPG预制胶条（pH3～10非线性）。冻干样品500μg溶解于400μL水化缓冲液（0.2%Bio-Lyte 3/10ampho两性电解质，0.001%溴酚蓝），胶内被动水化上样，胶条溶胀时间18h。等点聚焦时长为30 000V hr，胶条依次在平衡液1和平衡液2中震荡浸润15min后转入16%分离胶，20mA恒定电流30min，25mA恒定电流继续电泳7.5h。电泳结束后迅速剥离凝胶，置于考马斯亮蓝染色液中，染色液配制方法参照文献[12]。凝胶脱色至背景清晰后放入EXQuest spot cutter切胶系统，选取显色清晰的胶点精细切取。

2.4 质谱分析切取的凝胶用50mmol/L碳酸氢铵/乙腈振荡清洗，胶粒脱色完全后用测序级胰蛋白酶37℃胶内酶解过夜提取多肽，用Zip Tip脱盐后合并酶解液冻干。冻干后的酶解样品用20%乙腈完全复溶，吸取1μL和CHCA基质溶液按2:1体积比混合后点样，自然干燥后，样品靶用氮气吹净放入仪器进靶槽，用串联飞行时间质谱仪（5800MALDI-TOF/ TOF，AB SCIEX）进行测试分析。质谱检测参数：激光源为波长355nm的Nd：YAG激光器，加速电压为2kV，采用正离子反射模式和自动获取数据的模式采集数据，一级质谱（MS）扫描范围为800～000Da，选择信噪比>50的母离子进行二级质谱（MS/MS）分析，每个样品点上选择8个母离子，二级质谱（MS/MS）累计叠加2500次，碰撞能量2kV。

2.5 数据库检索质谱原始文件用Mascot2.2软件检索NCBI中的有鳞目（Squamata）蛋白质数据库，寻找匹配的肽段序列及相关蛋白质。搜库参数如下：Typeofsearch：Combined（MS+MS/MS）；Enzyme：Trypsin；Fixedmodifications：Carbamidomethyl（C）；Dynamical modifications：Oxidation（M）；Mass values：Monoisotopic；PeptideMassTolerance：±100ppm；FragmentMassTolerance：±0.4Da；PeptideCharge State：1+；Max Missed Cleavages：1

3 结果与分析

3.1 多肽溶出率烘干后，药材粉末称重为24.817g。BAC法测定不同浓度蛋白标准液对应的吸光度，并绘制成0～0.5mg/mL浓度区间内的标准曲线，标准曲线方程为：y=0.9628x-0.1201（R2=0.9978），计算醇提液中总蛋白含量为1.360g，计算肽类成分溶出率为5.48%。

3.2 凝胶电泳分析凝胶图像显示，蕲蛇药材经过稀乙醇热浸，溶出多种肽类成分，其中2kDa左右的多肽在弱酸性、中性及弱碱性的等电点（PI）区间内均有分布；在接近中性PI的区域发现两个多肽胶点，相对分子量在15kDa（图1，封底）。

3.3 肽段质谱鉴定凝胶中的多肽胶点经过脱色和测序级trypsin胰蛋白酶酶解后抽提胶内的肽段，采用MALDI-TOF-TOF MS串联质谱分析。获得的数据采用一级肽指纹质量与二级肽碎片质量综合分析法Combin-ed（MS+MS/MS），用MASCOT在NCBI有鳞目（Squamata）蛋白质库进行搜索；一、二级质谱综合得分及可信度参数分别设定为Protein Score≥60，Protein Score CI%≥95%。其中，从2号胶点酶解肽段的一级质谱选择质量质量较高的5个母离子（图2，封底），对其碎片进行二级质谱鉴定，最终匹配到5个肽段，总分为323，属于木纹响尾蛇（Crotalus horridus）以及东部菱背响尾蛇（Crotalus adamanteus）的骨骼肌肌动蛋白（Actin，alpha skeletal muscle），氨基酸序列分别为GYSFVTTAER（图3A，封底），AVFPSIVGRPR（图3B，封底），QEYDEAGPSIVHR（图3C，封底），IWHHTFY-NELR（图3D，封底），SYELPDGQVITIGNER（图3E，封底）。另外，从3号胶点的酶解肽段的一级质谱图谱中（图4，封底）挑选信噪比> 50的母离子对其碎片进行二级质谱分析，鉴定出一个肽段，属于镜王蛇（Ophiophagus ha-nnah）胶原蛋白α链上的一个片段，得分为66，其氨基酸序列为GESGPAGPAGPAGPAGAR（图3F，封底）。

4 讨论

已有研究[2]表明，蕲蛇每克药材含核苷类成分0.5～1mg，总磷脂13～44mg[3]，含量较低且对其药效尚无相关报道，只能作为考察药材质量的参考指标。《脉症治方》[13]、《杂病广要》[14]等古籍在用药上特别指出用“蕲蛇肉”或“去皮骨取净肉”，据此推测相对于皮和骨，蛇肉可能是药效成分富集的部位。蛇类药材以干燥全蛇入药，总氨基酸含量很高[15]，在蛋白质水平的研究上，通过生物酶解方法来获取活性蛋白已经取得一些进展，但对于传统的煎煮及酒浸方法中获取的蛋白/多肽成分的研究尚无相关的报道。

本研究引入蛋白质组学方法分析蕲蛇乙醇提取物中的肽类成分，凝胶图像显示在弱酸性，中性及弱碱性的等电点区间内均有多肽分布，而各区间内的多肽等电点接近，推测它们是由药材中原始的大分子蛋白溶出后受热分解的片段和游离氨基酸随机重排形成，这些随机形成的肽段由20个左右的残基组成，分子量主要集中在2kDa区域，难以在已有的数据库中找到匹配的序列。可能的原因包括：一是目前蛇类蛋白数据库中的肽段序列信息还不够全面；二是经过重排后的肽段序列与天然的片段序列发生较大变化。我们计划通过色谱纯化分离后进行Edman降解测序来进一步发现可能的活性片段。

刘端勇等[16]认为，虫蛇类动物药所含蛋白经过高温煎煮后变性分解，成为无生物活性的游离氨基酸。本研究的结果表明以上观点并不准确。对凝胶上10-15kDa范围内的两个多肽胶点胶内酶切后进行质谱分析和蛋白数据检索，高置信度匹配木纹响尾蛇和东部菱背响尾蛇的α骨骼肌蛋白中的多个肽段序列，这表明蕲蛇干燥药材中的蛋白在溶出过程中并未完全降解，除了游离氨基酸，还存在结构稳定的肽类成分。近年研究显示，β-actins是类风湿关节炎的一类重要致病性抗原[17-18]，而actin家族成员间序列高度同源。由此推测，这些多肽片段可能与特异性抗原的耐受相关。此外还从三号凝胶点匹配到眼镜王蛇（Ophiophagus hannah）胶原蛋白α链上由18个残基组成的一个肽段。我们注意到这一片段中包含一段完整的抗原表位的核心序列GPAGTAGAR，研究显示这一序列具有免疫原性，但无致关节炎性[19]。

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（收稿：2016-10-26修回：2016-12-04）

Proteomatic Analysis of Peptides from Qishe Ethanol Extract

LIN Chen,WEN Chengping,FAN Yongsheng TCM Clinical and Experimental Institute,Basic Medical College,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou (310053),China

ObjectiveTo investigate peptides contained within the ethanol extracts of Chinese herb Qishe（Agkistrodon acutus（Guenther））by a proteomic analysis.MethodsEthanol extracts of Qishe were produced following steps recorded in the Chinese pharmacopeia.Polypeptides within the samples were initially separated by two-dimensional electrophoresis.Valid spots were cut and trypsin-proteolysed,and were analyzed using TOF-TOF mass spectrometry,data from which were searched in the database to establish the identification.ResultsExtraction rate was 5.48%per gram crude medicine.Polypeptides separated by electrophoresis mainly distributed at 2kDa mark area, indicating their composition of 15-20 amino acids.Produced mass data from two gel spots within 10-15kDa mark area were identified in the database as fragments of skeletal alpha（α）-actin and Type I collagen.ConclusionHeating of ethanol is effective to produce extracts containing polypeptides from Qishe.

agkistrodon acutus;polypeptides;proteomics;electrophoresis;mass spectrometry

浙江中医药大学校级科研基金人才专项项目（No.2013ZR01）；浙江省教育厅一般科研项目（No.Y201430952）

浙江中医药大学基础医学院中医临床基础研究所（杭州31 0053）

林晨，Tel：13588825780；E-mail：linchen@zcmu.edu.cn