阿尔茨海默病转基因动物模型及中药组分治疗研究进展

王菁

阿尔茨海默病转基因动物模型及中药组分治疗研究进展

王菁

阿尔茨海默病；转基因；动物模型；中药组分

阿尔茨海默病（alzheimer's disease，AD）是一种以进行性记忆减退、认知功能障碍为特征的神经退行性疾病，已成为老年人群中继心血管病、肿瘤和脑卒中之后的第四大死亡因素[1]。目前全世界AD患者高达3600万，至2030年将有6570万患者，全球用于AD的医疗费用超过6040亿美元[2]。AD临床表现记忆力和思维能力减退，发展为语言表达困难、丧失生活自理能力，最终死于感染等严重并发症。AD主要病理特征为细胞外以β-淀粉样蛋白（betaamyloid，Aβ）沉积为核心形成的老年斑、细胞内以过度磷酸化的tau蛋白为核心形成的神经原纤维缠结（neurofib-rillary tangles，NFT）以及特定脑区中枢神经元大量丢失[3]。

1 以Aβ为基础的转基因小鼠模型

现阶段制备转基因动物模型的思路主要以体现AD特征为导向，模拟AD病理特征制备转基因小鼠成为研究AD的重要手段。以β-淀粉样蛋白沉积为核心形成的老年斑是AD主要病理特征之一，淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）在非淀粉样蛋白水解途径中，α-分泌酶催化APP不产生Aβ沉积，其催化裂解后的APPs片段和羧基端片段中均不含完整的Aβ，故该途径不产生老年斑的沉积；在淀粉样蛋白水解途径中，β-分泌酶和γ-分泌酶分别催化APP产生Aβ沉积，β-分泌酶在Aβ氨基端的位置切断APP，生成一段APPs和包含Aβ的羧基段片段，后者又被γ-分泌酶催化剪切，最终释放出Aβ[4]。脑内Aβ斑块沉积导致神经元变性坏死和周围胶质细胞和小胶质细胞的过度活化，最终引起局部炎症反应，导致认知功能障碍，最终发展成AD[5]。

大多数研究者主要使用家族性AD中APP和PSEN（早老蛋白）突变基因来构建转基因小鼠模型。PSEN突变基因与人类早期AD发展密切相关，但是仅表达人类PSEN1（早老蛋白1）或PSEN2（早老蛋白2）突变基因的转基因小鼠并未出现Aβ斑块沉积[6]。Tg2576转基因小鼠是转人类APP695基因小鼠，到5月龄时能检测到Aβ沉积，随着Aβ沉积逐渐增加，学习记忆能力损伤。与单转基因小鼠相比，表达人类PSEN1和APP突变基因的双转基因小鼠能更快形成Aβ斑块沉积，同时还出现神经炎症反应和认知功能减退[7]。其中β-分泌酶在内稳态神经功能和催化APP产生Aβ中具有重要作用。相比仅APP转基因小鼠，表达BACE1和APP的双转基因小鼠Aβ形成速度更快和更多Aβ沉积[8]。

2 作用于β-淀粉样蛋白的药物

针对Aβ在AD发病机制中的重要地位，如何减少Aβ的产生成为治疗AD的关键环节之一。与Aβ密切相关的分泌酶是至今AD药物开发的关键靶点，一方面α-分泌酶催化可溶性βAPP产生，从而抑制Aβ的生成；另一方面通过抑制β-或γ-分泌酶则能减少Aβ沉积[4]。

2.1 β-分泌酶抑制剂β-分泌酶是催化Aβ产生的初始和控速步骤，在Aβ生成过程中起决定性作用。抑制β-分泌酶的活性能从上游控制Aβ生成，从而起到防治AD的作用[3]。β-分泌酶抑制剂作为AD治疗药物，需要满足以下条件：具有较高的抑制活性，较强的特异性，良好的生物利用度，最关键的是能够穿越血脑屏障，这也是研发中所面临的最大挑战[9]。

目前作用于β-分泌酶的中药有效成分研究取得长足进步，其中研究最常见的人参皂苷Rg1能够通过激活PPARγ活性，抑制β-分泌酶的转录翻译，从而下调β-分泌酶mRNA和蛋白的表达水平，最终减少Aβ生成[10]。李维组[11]发现黄芪总苷通过抑制APP表达，降低β-分泌酶分泌以及促进α-分泌酶释放，进而抑制Aβ生成，最终改善AD小鼠学习记忆功能。研究表明[12]，三七皂苷R1能够通过雌激素受体通路来抑制β-分泌酶的表达，从而降低AD患者脑内神经元中Aβ含量。体外试验[13]发现，淫羊藿黄酮和淫羊藿苷能显著性抑制细胞中β-分泌酶活性，减少APP基因转染和Aβ生成。Zhu等[14]研究发现黄连素通过激活细胞外信号调节激酶1/2途径，下调β分泌酶表达，从而减少Aβ的产生。官杰等[15]研究复方还脑益聪方对APP转基因AD模型小鼠脑内Aβ、β-分泌酶表达的影响，发现其通过减少β、γ-分泌酶以及APP表达，抑制Aβ产生来改善AD小鼠学习记忆功能。

综上所述，虽然中药组分和天然产物作为β-分泌酶靶标的抑制剂取得了一定的成绩，但还存在明显的不足[9]。此外，天然产物的药理作用机制复杂，对β-分泌酶的抑制作用研究仅停留于药效学研究水平，具体作用机制还有待进一步研究。

2.2 γ-分泌酶抑制剂γ-分泌酶是一种存在于内质网和高尔基体的多亚基整膜蛋白复合体，主要参与APP重要跨膜蛋白的切割和水解过程。研究表明，γ-分泌酶是由四个亚单元（PS、NCT、APH1和PEN2）组成的膜内蛋白水解酶。其中，四个亚单位中PS在跨膜蛋白处理中发挥核心作用，是引起家族性AD的主要原因；NCT具有γ-分泌酶的底物结合位点，即γ-分泌酶的底物首先由NCT特异性结合。APH1和PEN2是γ-分泌酶裂解sAPPβ所必需的[16]。

γ-分泌酶抑制剂的设计原则为将γ-分泌酶作为天冬氨酸蛋白酶的特性以及底物APP的结构特点为依据，主要为肽醛类、双氟酮类、羟乙基类等人工合成化合物。研究[17]表明，γ-分泌酶抑制剂LY-411575化合物能使APP小鼠中海马区Aβ水平降低，同时未发现Notch信号途径异常，但遗憾的是具有很强的胃肠道副作用。目前，以γ-分泌酶为靶点的中药单体研究已成为中医药防治AD的新途径。研究[18]表明，淫羊藿苷能下调快速老化小鼠（SAMP8）海马中PS1基因表达，可能是通过抑制γ-分泌酶活性进而起到治疗AD的作用。何首乌中水溶性成分二苯乙烯苷能下调APP转基因小鼠海马区PS1表达和抑制γ-分泌酶活性，进而达到防治AD的作用[19]。体外研究[20]表明，海风藤中五味子乙素能抑制M146L细胞中γ-分泌酶活性，从而降低Aβ1-42表达。姜黄素能够改善APP/PS1双转基因小鼠的学习记忆能力，提示可能是通过减少海马CA1区PS2阳性表达，抑制γ-分泌酶活性，降低Aβ表达水平[21]。以上中药有效成分对γ-分泌酶均具有一定的干预作用，为AD治疗和预防提供理论和实验基础，也将是今后的一个主要研究方向。

3 以tau蛋白磷酸化为基础的转基因小鼠模型

在构建具有β-淀粉样蛋白沉积病理特征的转基因小鼠过程中发现，许多APP转基因小鼠出现AD病理学和行为学改变先于β-淀粉样蛋白沉积。虽然这些转基因小鼠中具有Aβ斑块沉积和认知功能障碍，但是它们没有解决另一个主要的AD病理特征—神经原纤维缠结[22]。

tau蛋白是一种微管相关蛋白，正常状态下可促进微管蛋白形成微管，并维持细胞骨架的稳定性和神经元可塑性[22]。tau蛋白由位于17号染色体上的tau基因选择性剪切表达。由于tau蛋白过度磷酸化形成NFT，导致细胞骨架稳定性下降，相关的轴突运输障碍以及相应神经元的活性降低。那么Aβ淀粉样斑块和NFT两者之间存在怎么的关系？Aβ淀粉样斑块和NFT怎样诱导AD发生？这些难题至今未解决。

为了阐明tau蛋白异常磷酸化在AD发病机制中的作用，试图采用过表达野生型或人类突变tau基因来制备转基因模型小鼠来寻找突破口。研究[23]发现G272V和P301S突变的tau基因导致转基因小鼠NFT的形成和严重的认知功能障碍。tau转基因小鼠JNPL3，开始未出现Aβ淀粉样斑块和认知障碍，后期才出现神经元丢失和NFT病理变化。为了模拟与AD相关的NFT病理改变，tau基因敲除小鼠与表达人基因组tau的小鼠杂交，最终表达人类而不是小鼠tau基因[24]。在制备转基因动物模型时，未真正考虑到物种本身所携带的基因表达情况，导致有些转基因动物模型未能表现理想的AD病理特征。

为了弥补单转基因小鼠模型未能完全模拟Aβ斑块和NFT的缺点，能同时表达人类APP、PSEN和tau基因的三转基因小鼠模型被逐渐重视。Tanemura等[25]建立了APP、PSEN和tau基因的三转基因小鼠模型，能同时模拟出Aβ和tau病理特征，即生成具有神经毒性的Aβ和磷酸化tau蛋白，进而形成老年斑和NFT。另外，三转基因小鼠能够模拟其他AD病理和行为学特征包括：胶质增生、突触损伤和学习记忆障碍[26]。

4 作用于tau蛋白磷酸化的药物

目前，tau蛋白磷酸化水平是体内多种蛋白激酶的磷酸化和脱磷酸化之间平衡所致，因此以抑制蛋白激酶磷酸化活性或增强脱磷酸化酶活性为思路而开发的小分子抑制剂成为抗AD药物研究的重要方向之一[27]。现阶段研究最多的GSK-3β和CDK5是最有效的磷酸化tau蛋白激酶之一，与NFTs存在高度的共定位，酶活性与tau蛋白过度磷酸化成正相关，因此被认为是与AD密切相关的关键tau蛋白磷酸化激酶[28-29]。中药成分黄连素作用于igAPP突变小鼠发现，其通过抑制GSK-3β活性，进一步通过AKT/ GSK-3β信号通路，减少β-CTF的生成，降低非可溶性Aβ的产生[30]。中药成分山茱萸环烯醚萜苷（CIG）能够抑制tau蛋白磷酸化，促进神经干细胞增殖和神经元分化，对细胞和动物模型均能起到神经保护作用[12]。

5 结语与展望

尽管最为广泛使用的多转基因动物模型能在遗传学上模拟AD特征性病理学特征包括细胞外Aβ沉积和NFT等，但是还不能完全模拟出人类AD的所有特征。随着转基因模型研究的不断进步，理想的转基因模型将不断出现，届时将加快AD治疗药物筛选。

AD是一种由多致病因素所致疾病，依据“单一分子、单一靶标”的理论研究的药物只能缓解AD病情而非治愈。近年来，随着对网络药理学和多向药理学的认识，研究者逐渐改变单靶点药物治疗的思路，开发能同时调控多个靶点的高效而安全的“多靶点导向的活性配体”，提供了更广阔的AD药物研发思路。

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（收稿：2016-09-09修回：2016-12-16）

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