青藤碱对脓毒血症模型大鼠急性肾损伤的保护作用

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(中南大学湘雅二医院急诊科，湖南 长沙 410000)

·基础医学·

青藤碱对脓毒血症模型大鼠急性肾损伤的保护作用

李雄辉1，张东山*

(中南大学湘雅二医院急诊科，湖南 长沙 410000)

目的探讨青藤碱(SIN)对脓毒血症大鼠急性肾损伤的保护作用。方法将SD大鼠75只随机均分为假手术组、脓毒血症模型组和SIN小、中、大剂量组，建模，术后24 h采用ELISA法测定血清、尿液中性粒细胞明胶相关脂质转运蛋白(NGAL)、肾损伤分子1(KIM-1)水平及血降钙素原(PCT)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)浓度，并对结果进行统计分析。结果和脓毒血症模型组相比，SIN大、中剂量组NGAL和KIM-1均显著降低；SIN大、中、小剂量组PCT均较脓毒血症组显著降低，而BUN及Scr均显著低于模型组；SIN大剂量组肾脏病理明显改善。结论SIN有效降低血清和尿液NGAL和KIM-1，降低血清PCT、BUN和Scr浓度，对脓毒血症所致的急性肾损伤起到一定保护作用。

SIN； 脓毒血症； 急性肾损伤； NGAL； KIM-1

脓毒血症是临床上常见的严重的感染性疾病，如果得不到及时治疗，病死率较高。近年来，尽管抗感染治疗和器官功能支持疗法取得了长足进步，但脓毒血症的病死率仍高达30%～70%[1]，急性肾损伤 (acute kidney injury，AKI) 是脓毒血症患者常见且严重的并发症[2]。有研究表明，从传统中药青风藤中提取的生物碱单体青藤碱(Sinomenine，SIN)具有免疫抑制、抗炎镇痛等多种药理作用[3]，且临床上已经被应用于类风湿性关节炎等自身免疫性疾病的治疗，疗效获得肯定。本文拟建立一个大鼠脓毒血症模型，探讨SIN对脓毒血症模型大鼠急性肾损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1实验动物75只雄性SD大鼠，体重250～300 g，购自斯莱克景达实验动物公司，许可证号：SCXK(湘)2011-0003。大鼠术前3天单独放入代谢笼，给予等级饲料喂养并自由饮水。

1.2主要药物、试剂及仪器SIN购自湖南正清制药有限公司，纯度大于95%。血清降钙素原(procalcitonin，PCT)试剂盒(德国BRAHMS Diagnostica 公司)；大鼠中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(neutrophil related lipid transport protein，NGAL) 试剂盒(上海蓝基生物有限公司)；大鼠肾损伤分子-1( kidney injury molecule 1，KIM-1)试剂盒(上海蓝基生物有限公司)；Vitros 250型全自动生化分析仪(美国强生公司) ；ELX800 型酶标仪(美国BIO-TEK仪器公司)。

1.3试验方法按照随机数字表法，75只大鼠随机分成假手术组、脓毒血症模型组、SIN小剂量组、SIN中剂量组和SIN大剂量组，每组15只。术前禁食12 h，麻醉采用10%水合氯醛溶液腹腔注射，剂量为3.5 mL/kg，麻醉满意后，固定、消毒及备皮，沿腹中线切开皮肤约1.5 cm，探查到盲肠将其结扎，注射器针头刺穿被结扎盲肠头尾端，挤压出盲肠内容物，无需清洗将盲肠和内容物送回腹腔，关腹。假手术组大鼠仅探查盲肠，不结扎盲肠和造成穿孔。SIN小剂量组、中剂量组和大剂量组在手术结束时分别在尾静脉注射剂量为25、50、100 mg/kg SIN。假手术组及脓毒血症组均注射生理盐水0.5 mL。术中如出现大鼠提前复苏，酌情给予0.1～0.2 mL水合氯醛溶液，以助手术顺利进行。术后大鼠即送入代谢笼，各种原因导致24 h内死亡的大鼠均被剔除出组，重新补充大鼠继续观察。

1.4资料收集术后24 h观察大鼠毛色、寒颤和腹腔情况并记录，收集尿液并处死大鼠，收集大鼠下腔静脉血液并取下大鼠肾脏。静脉血和尿液均常温下放置1 h，离心(3 000 r/min，10 min)，留取上清液，备用。

1.4.1 血清NGAL和KIM-1水平测定 均采用ELISA法，分别按照试剂盒说明书进行操作，反应中止后，各孔于波长450 nm的酶标仪上读取光密度(D) 值。根据标准品的浓度及D值画出曲线图，分别确定对应的浓度范围。

1.4.2 尿液NGAL和KIM-1蛋白测定 采用ELISA法检测，方法同上。

1.4.3 血清降钙素原(PCT)测定 采用ELISA法严格按照试剂盒要求进行操作。

1.4.4 血清Scr、BUN测定 采用全自动多功能生化分析仪，按照步骤进行检测。

1.4.5 大鼠肾脏病理形态学 采用HE染色进行观察，经过石蜡切片、脱蜡、脱二甲苯、核染、分化与漂洗、染色、脱水、透明和封片等步骤获得病理切片标本。

1.5统计学方法采用SPSS 19.0分析软件对数据进行处理，计量资料采用均数±标准差表示，运用t值检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1大鼠术后一般情况除假手术组，其他各组均有不同程度呼吸急促，毛色欠光滑；假手术组及SIN大剂量组无寒战现象，其他各组均不同程度出现寒战，以脓毒血症组和SIN小剂量组为甚；除假手术组，其余各组均出现腹腔脓肿，SIN大剂量组仅出现3例，而脓毒血症组及SIN小剂量组所有大鼠均出现腹腔脓肿。

2.2大鼠血清各项指标比较血清NGAL和KIM-1比较，假手术组NGAL和KIM-1均显著低于脓毒血症模型组；SIN大、中剂量组NGAL和KIM-1均显著低于脓毒血症模型组(P<0.05)，SIN小剂量组NGAL和KIM-1和脓毒血症模型组相比较，差异无显著性(P>0.05)。见表1。大鼠血清PCT比较，SIN大、中、小剂量组PCT进行两两对比，差异均有显著性(P<0.05)，且均显著低于脓毒血症模型组(P<0.05)；和假手术组比较，SIN中、小剂量组PCT显著增高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清NGAL、KIM-1、PCT比较(ng/L，n=15)

与假手术组比较，a：P<0.05；与脓毒血症模型组比较，b：P<0.05

2.3尿液NGAL和KIM-1浓度比较假手术组NGAL和KIM-1均显著低于脓毒血症模型组；SIN大、中剂量组NGAL和KIM-1均显著低于脓毒血症模型组(P<0.05)，SIN小剂量组NGAL和KIM-1和脓毒血症模型相比较，差异无显著性(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠尿液NGAL、KIM-1比较(ng/mL，n=15)

与假手术组比较，a：P<0.05；与脓毒血症模型组比较，b：P<0.05

2.4大鼠血清Scr、BUN比较SIN大、中、小剂量组BUN及Scr均显著高于假手术组(P<0.05)，低于脓毒血症组(P<0.05)，假手术组和脓毒血症模型组进行比较，差异有显著性(P<0.05)。见表3。

2.5大鼠肾脏病理形态学观察假手术组光镜下肾脏形态学改变差异不明显。脓毒血症模型组和SIN小剂量组肾小球体增大，较多肾曲小管上皮呈轻中度浊肿变性，胞浆内红染的颗粒数目明显增多、增粗，可见数个小灶状小管坏死，部分管腔内可见管型。SIN中剂量组肾小球体增大，肾小球毛细血管轮廓稍显模糊，小部分肾曲小管上皮呈轻中度浊肿变性，胞浆内红染的颗粒数目增多，颗粒可见增粗，可见小部分小灶状小管坏死及管型。SIN大剂量组肾小球体稍大，肾小球毛细血管轮廓较清晰，小部分肾曲小管上皮呈轻度浊肿变性，胞浆内红染的颗粒数目有所增多，但颗粒未见增粗，无小管坏死及管型形成。见图1。

表3 各组大鼠血清BUN、Scr比较(n=15)

与假手术组比较，a：P<0.05；与脓毒血症模型组比较，b：P<0.05

图1 大鼠肾脏病理形态学观察

3 讨 论

脓毒血症其实质是全身性炎症呈恶性发展的状态，常合并AKI，部分患者如不采取及时有效的阻断措施，容易发展为多器官功能衰竭。最新文献表明，炎症介质在脓毒血症的发生发展中起关键作用，其血浆浓度与疾病的严重程度和预后明显相关[4]。在脓毒血症急性肾损伤发生过程中，免疫介导的肾小管功能紊乱比肾缺血更重要，提示AKI的发病机制是复杂的[5]，抑制机体免疫反应而达到有效治疗脓毒血症急性肾损伤可能是一个方向。

SIN主要用于治疗类风湿性关节炎及自身免疫性疾病，疗效肯定。文献报道[6]SIN可以降低IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-17A、IL-1β水平，升高IL-10水平，减轻全身炎症反应。王竹等[7]发现SIN可抑制DC细胞的生物学活性，减少DC的炎症因子分泌。文娟[8]发现SIN能改善临床症状和减少炎性病灶，SIN上调中枢神经系统内TGF-β1的表达，并指出这可能是SIN发挥其保护作用的机制之一。可见，SIN的抗炎作用也是多通道的。

目前已有多个有预测脓毒血症相关AKI有价值的生物标志物被发现，如NGAL和KIM-1。NGAL是一种损伤诱导的转铁蛋白，一般情况下组织中表达很少，在缺血和肾毒性小鼠模型中可检测到NGAL迅速升高，检测能够早期发现肾损伤，NGAL评价肾功能方面可能优于传统的检测指标[9]。Kim-1肾脏近曲小管上皮细胞表达的一种跨膜蛋白，在正常肾脏内表达水平极低，当肾急性损伤后，近端小管细胞内Kim-l基因转录水平急剧上调，Kim-l蛋白也随之大量表达，随着结构与功能的恢复，Kim-1这种高表达的现象也会消失[10]。类似现象在另外一篇文献也被报道[11]。本研究结果发现，大、中剂量SIN组的NGAL和KIM-1无论是采用血清标本还是尿液，均明显低于脓毒血症组，提示大、中剂量SIN能明显降低大鼠AKI时NGAL和KIM-1，而在脓毒血症导致AKI中，小剂量SIN并无明显保护作用。大、中剂量SIN组组间比较差异无显著性，可能提示本研究中采取50 mg/kg的剂量已使相关作用受体饱和，具体机制如何尚需进一步研究。假手术组的NGAL和KIM-1显著低于脓毒血症组，提示大鼠脓毒血症造模是成功的。

研究发现，发生AKI时PCT升高早于血肌酐的升高[12]，被认为是识别脓毒血症的一个早期敏感指标,可作为脓毒血症诱导急性肾损伤患者的预测指标[13]。本研究将SIN各组进行两两对比，PCT值差异显著，SIN剂量越大，PCT值越低；将SIN各组分别与脓毒血症模型组进行对比，发现脓毒血症组PCT值较SIN组明显增高，两组数据均提示了SIN能有效降低PCT值，有效减轻了脓毒血症导致AKI对机体的破坏性作用。AKI严重程度最直接的反映就是机体的肾功能。临床和科研上评价肾功能一般常用Scr和BUN两个观察指标。本研究中，脓毒血症组Scr和BUN最高，低剂量SIN组次之，余下依次为中剂量SIN、高剂量SIN组和假手术组。本研究中，脓毒血症组和低剂量SIN组组间比较差异有显著性，提示低剂量SIN在保护肾功能方面同样有益。而前文述及，小剂量SIN并不能明显降低大鼠AKI时NGAL和KIM-1浓度。NGAL和KIM-1是研究肾功能变化观察指标之一，SIN对肾功能的保护作用是否还有其他机制参与有待进一步研究。大、中剂量SIN组的Scr和BUN较脓毒血症模型组显著降低，但显著高于假手术组，说明合适剂量的SIN具有一定的减轻脓毒血症导致的AKI。而评价肾功能最直接的办法就是进行病理切片检查。本研究中，脓毒血症组大鼠肾脏胞浆内红染的颗粒数目明显增多、增粗，肾小管坏死，甚至管型形成，上述现象提示大鼠肾脏出现了较为严重的感染，小剂量的青藤碱的病理呈现高度相似的结果，提示小剂量的青藤碱不能改善肾脓毒血症的结局。随着青藤碱剂量增大，中剂量青藤碱组的病理较小剂量组有了一定改善，直到大剂量青藤碱组可以发现，胞浆内红染的颗粒未见增粗，无小管坏死及管型形成，提示在该剂量青藤碱参与下，脓毒血症大鼠肾脏病理结果有了较大的改善，证实了合适剂量的青藤碱对脓毒血症大鼠肾脏具有一定的保护作用。本研究设计上也有不足之处，因观察时间短，保护作用是否持久，能否替代其他治疗措施缓解甚至逆转脓毒血症导致的AKI，本实验尚需进一步研究。

综上，SIN对脓毒血症导致急性肾损伤具有一定保护作用，具体作用机制可能是多方面的，本研究为SIN应用于脓毒血症致急性肾损伤的保护作用研究提供了实验依据。

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Protectiveeffectsofsinomenineonacuterenalinjuryinsepticrats

LI Xionghui,ZHANG Dongshan

(EmergencyDepartment,theSecondXiangyaHospital,CentralSouthUniversity,Changsha410000,Hunan,China)

ObjectiveTo investigate the protective effect of sinomenine on acute kidney injury in rats with sepsis.Methods75 SD rats were randomly divided into sham operation group,sepsis group and sinomenine,in modeling large,middle and small dose group,and after 24 h ELISA was used to test serum,urine neutrophil related lipid transport protein gelatin (NGAL),kidney injury molecule 1 (KIM-1) and the level of serum procalcitonin (PCT),blood urea nitrogen (BUN),serum creatinine (Scr) concentration,and the results were statistically analyzed.ResultsCompared with the sepsis group,the NGAL and KIM-1 in the large and middle dose group of sinomenine were significantly lower than those in the sepsis group,and the PCT of the large,middle and small dose group were significantly lower than those of the sepsis group,while BUN and Scr were significantly lower than those in the model group.SIN large dose group significantly improved renal pathology.ConclusionsSinomenine can effectively reduce serum and urine NGAL and KIM-1,decrease serum PCT,BUN and Scr,and play a protective role on acute kidney injury induced by sepsis.

sinomenine; sepsis; acute kidney injury; NGAL; KIM-1

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2017.03.008

2017-01-03；

2017-04-14

*通讯作者，E-mail：zhkidney@qq.com.

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