三种饲料建立大鼠缺铁性贫血模型的比较

丁广宇, 潘绵立, 胡 寒, 刘 艺, 沈龙海

(中国医药工业研究总院上海医药工业研究院,上海市生物物质成药性评价专业技术服务平台, 上海 200437)

三种饲料建立大鼠缺铁性贫血模型的比较

丁广宇, 潘绵立, 胡 寒, 刘 艺, 沈龙海

(中国医药工业研究总院上海医药工业研究院,上海市生物物质成药性评价专业技术服务平台, 上海 200437)

目的 探讨三种不同饲料配方对建立Wistar大鼠缺铁性贫血模型的影响。方法 将3～4周龄Wistar大鼠分为4组，即A、B、C和正常对照组， A、B、C组分别饲喂3种不同配方饲料,正常对照组饲喂正常饲料。实验持续35 d, 实验期间每周称量各组大鼠体质量及摄食量同时观察大鼠行为、外观体征等变化。35 d后取血, 检测相关血常规指标包括血红蛋白(Hb)含量、红细胞压积等。结果 A组大鼠Hb含量降到90 g/L以下, 且行为和体态表现也符合缺铁贫血特征, 达到造模要求; B组大鼠Hb含量没有降低; C组大鼠Hb含量有所降低, 但未达到90 g/L以下。结论 A组饲料配方可以成功建立大鼠缺铁性贫血模型，B、C组配方均不适用于缺铁性模型的建立。

缺铁性贫血; Wistar大鼠; 血红蛋白(Hb)

铁是机体内多种重要活性大分子的组成部分,尤其是红细胞中的血红蛋白, 当机体对铁的摄入失衡, 将导致体内(如肝脏)的贮存铁耗尽(iron deleption, ID),随后红细胞内铁缺乏(iron deficiency, IDE), 血红蛋白合成降低, 最终引起缺铁性贫血(iron deficiency anemia, IDA)。IDA是铁缺乏症(包括ID, IDE和IDA)的最终阶段，表现为细胞中含铁酶和铁依赖酶的活性降低，进而影响患者的精神、行为、体力、免疫功能，其发病率在发展中国家、经济不发达地区偏高，常见于婴幼儿和育龄妇女[1]。

目前针对这一疾病的药理学研究, 多采用大鼠构建IDA模型。建模方法有定期放血或者饲喂低铁饲料，这两种方法各有优缺点: 剪尾放血成本低，但方法操作烦杂，而且建立的模型容易产生失血反应，不易成模，且非单纯的缺铁性贫血。后者虽方法简单，但对饲料质控要求严，成本较高，且大鼠容易产生排斥[2]。因此开发简单易行的造模方法，对于该疾病的研究及药物筛选具有重要意义。

缺铁性贫血形成的主要原因是铁的摄入量不足、吸收障碍和丢失过多。草酸存在于很多植物中，摄入的草酸在肠胃道与可溶性铁离子形成难溶性络合物，从造成铁的吸收障碍[3]，与其相似，四环素与铁离子相互作用时也能形成复杂的难溶性复合物从而影响铁的吸收。本试验用A配方即缺铁饲料和添加了草酸(B配方)和四环素(C配方)的正常饲料，考察不同饲料对于IDA造模的影响。通过比较三组饲料配方的大鼠实验结果，旨在寻找简易、有效的建立大鼠贫血模型方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

3～4周龄清洁级雌性Wistar大鼠40只，体质量70～75 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供[SCXK(沪)2012-0002]，饲养于上海医药工业研究院动物实验设施[SYXK(沪)2014-0018]。

1.2 生化试剂和仪器

草酸，国药集团化学试剂有限公司生产，批号: 20150708; 四环素，北京赛孚制药股份有限公司，批号兽药字(2012)010281345; 饲料颗粒机/SKJ-120，上海汉丁机械科技有限公司; 动物血液分析仪/HEMAVET 950，英国Drew Scientific公司。

1.3 饲料

饲料配方A，由江苏美迪森生物医药有限公司提供[4]; 基础粉料和颗粒料，由上海普路腾生物科技有限公司提供。

1.4 实验方法

将40只Wistar大鼠按体质量随机分为4组，每组10只，分别为饲喂相对应配方饲料的A、B、C组，以及饲喂正常饲料的正常对照组D。用苦味酸标记编号放入笼内，每笼5只。

配方A: 玉米淀粉(529.5 g/kg)、蛋清蛋白(200.0 g/kg)、蔗糖(100.0 g/kg)、玉米油(70.0 g/kg)、纤维素(50.0 g/kg)、混合矿物盐(AIN-93G-MX) (35.0 g/kg)、混合维生素(AIN-93G-VX)(10.0 g/kg)、L-胱氨酸(3.0 g/kg)、氯化胆碱(2.5 g/kg)，配方来自SFDA有关大鼠缺铁性贫血实验方案[4]。

配方B: 标准饲料粉料, 添加草酸(850 mg/kg)。设计依据为: 草酸的大鼠LD50为7 500 mg/kg, 根据兰州大学化工学院分析测试中心用火焰法测得一般正常清洁级大鼠饲料中铁的含量为0.05%左右[5]，草酸和铁离子等摩尔数络合，根据大鼠每日摄食量约20 g换算，每只大鼠每日需要17 mg草酸，该数值低于其LD50，混合添加于粉状饲料中，充分搅拌均匀后由颗粒饲料机制粒。

配方C: 标准饲料粉料, 添加四环素(800 mg/kg),剂量设计依据为: 四环素的大鼠LD50为800 mg/kg,成人口服剂量0.2～0.5 g/d, 6 h一次, 约每日30 mg/kg,折算成大鼠以200 mg/kg计，实验时大鼠体质量为80 g，给药总量为16 mg，经过换算足够络合饲料中的铁离子，且低于LD50，混合入粉状饲料中，充分搅拌均匀后由饲料颗粒剂制粒。

所有大鼠都饮用灭菌自来水, 实验持续35 d，每日观察大鼠毛色、活动和消化状况，每周一测量每组大鼠体质量计算平均每只大鼠体质量，每周加入一定量饲料，通过称量饲料剩余量，来计算该周(7 d)平均每只大鼠每日的摄食量。

同时观察大鼠行为体态变化。35 d后取血，用全自动血清分析仪测定血清中的血红蛋白含量(Hb)、红细胞压积(HCT)、 红细胞平均血红蛋白量(MCH)、 红细胞平均容积(MCV)。

1.5 数据处理与统计方法

采用GraphPad Prism 6统计软件，所有实验数据用±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外观体征、活动状态、粪便形状

A组大鼠饲喂低铁饲料1～2周后大鼠活动减少，2～3周后，毛色粗糙失去光泽，有稀疏感，耳部和四肢皮肤相对于正常大鼠显青色。个别大鼠见颈部毛发脱落。粪便与正常大鼠相比显黄色，较稀，有恶臭。造模3周后体质量减轻，饮食未见减少。B组大鼠第1周对饲料排斥，好动狂躁，第2周后逐渐稳定。毛色和粪便正常。C组大鼠未见异常，活动状态和正常对照组大鼠相似。

2.2 各组大鼠摄食量比较

实验过程中各组大鼠摄食量呈上升趋势，但是各组上升趋势不同。A配方组大鼠摄食量低于正常组且在第3周后有显著差异(P＜0.05)。B配方组大鼠摄食量从第1周开始就明显低于正常组和C配方组(P＜0.05)。C配方组大鼠摄食量与正常组近似，与A、B两组差异显著(P＜0.05)(表1)。

表1 实验大鼠平均每日饲料摄食量 g /d

2.3 各组大鼠体质量比较

各组的体质量增长趋势不同。正常组体质量增长最快, 5周后体质量也高于其它3组。A组大鼠体质量低于正常组大鼠在第3周后有显著差异(P＜0.05)。第4周起，B配方组大鼠体质量增长明显低于正常组(P＜0.05)。C组体质量增长与正常组近似，与A、B组有显著差异(P＜0.05)(表2)。

2.4 血液指标

A组大鼠Hb、HCT、MCH含量均明显降低，其中Hb值30 d后降低到78.6 g/L左右，与正常组有显著差异(P＜0.05)。B组Hb值以及其它指标与正常组比较近似。C组大鼠Hb为128.6 g/L,低于正常组，但高于A组(P＜0.05)(表3)。

表2 大鼠体质量变化 g

表3 各组大鼠部分血液指标 g/L

3 讨论

A组大鼠在造模3周后出现贫血症状，主要表现为体型瘦小，被毛粗糙，失去光泽，有稀疏感，耳部和四肢皮肤相对于正常大鼠显青色。部分大鼠脖颈部皮毛出现脱落现象, 这可能是贫血造成的皮肤溃疡。A配方组大鼠Hb值降低到78.6 g/L左右，相对于正常组有显著性差异, 且低于90 g/L, 大鼠表现的行为体态特征也有助于判断为IDA，两个特征均与原文献报道[3,6]相符即A组造模成功，提示A配方低铁饲料能够快速建立大鼠缺铁性贫血模型; B配方组大鼠Hb值为169.6 g/L，与正常组的172. 3 g/L差异不显著，表明草酸并不能实质性减少铁吸收，影响血红蛋白的含量。可能原因是草酸虽然降低二价铁的吸收，但是会同时促进三价铁的吸收，因此并不会影响铁元素的摄入量, 导致造模失败[7]。C组大鼠与正常组大鼠比较，各项活动体征相似, 在实验结束后大鼠平均Hb值为128 g/L，较正常组有所降低，但未降低到100 g/L以下，达不到造模的要求。这可能是因为添加四环素的剂量不足，有待进一步研究。缺铁时，红细胞合成血红蛋白量减少，致使红细胞体积变小，所以营养性贫血大鼠的Hb减少，同时HCT值也降低，红细胞数量并没有变化。而A配方组大鼠Hb和HCT远低于正常对照组(P＜0.05), 符合缺铁性贫血特征。此外, 有文献报道[8], 在进行贫血大鼠造模时, 应该饲喂去离子水, 以防止外界铁离子干扰。本实验造模过程中使用的是灭菌后的自来水，对造模结果影响不明显，这是因为低铁饲料中的铁离子含量大约8.01 mg/kg, 而自来水中的铁离子含量为0.3 mg/L,低铁饲料中的铁含量远远大于自来水中铁离子含量，实验结果证明灭菌后的自来水对于单纯造模没有影响。

综上所述，经典的缺铁性贫血模型造模方法不论是在造模时间，还是造模效果上都表现非常出色，但是由于对它的饲料配方有严格要求，所以模型不易制备，此外单一的造模方法对于一种疾病而言并不具有说服力，因此，在此基础上进行了不同饲料配方的研究，尽管结果不甚满意，但是获得了一些经验教训，为下一步建立新的贫血模型打下了一定基础。

[1] Xiao C, Lei X, Wang Q, et al. Effects of a tripeptide iron on iron-deficiency anemia in rats[J]. Biol Trace Elem Res, 2016, 169(2):211-217.

[2] 刘戍年. 大鼠缺铁性贫血模型的建立[J]. 中国病理生理杂志, 1995, 11(4):361-362.

[3] 张琪, 徐达道. 膳食中铁吸收及其影响因素[J]. 国外医学:卫生学分册, 1986, 13(3):149-151.

[4] 国食药监保化[2012]107号. SFDA改善缺铁性贫血功能评价方法[S], 2012.

[5] 葛可佑. 中国营养科学全书[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2004:665- 668.

[6] 田婷, 冯楠. Wistar大鼠缺铁性贫血模型的建立[J]. 当代医学, 2011, 17(35):41-42.

[7] Genannt Bonsmann SS, Walczyk T, Renggli S, et al. Oxalic acid does not influence nonhaem iron absorption in humans: a comparison of kale and spinach meals[J]. Eur J Clin Nutr, 2008, 62(4):336-341.

[8] 呼延武, 马雅静, 秦楠, 等. 雌性大鼠缺铁性贫血模型的建立及相关指标观察研究[J]. 中国妇幼保健, 2015, 30(1): 128-130.

Comparative Study on Iron Deficiency Anemia Rats Model by Three Different Formula Feeds

DING Guang-yu, PAN Mian-li, HU Han, LIU Yi, SHEN Long-hai
(China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai Professional and Technical Service Center for Biological Material Druggability Evaluation, Shanghai 200437, China)

Objective To explore the effect on iron deficiency anemia rat model induced by 3 different formula feeds.MethodWistar rats at age of 3～4 weeks were randomly divided into 4 groups: group A, group B, group C and control group. The groups A, B, C were fed with 3 different formula feeds respectively, and control group was fed with normal feed. Experiment lasts for 35 days, the body weight and food intake of rats in each group were measured every week. Meanwhile, behavior and appearance sign was noted during the experiment. Rat’s blood was collected and tested after 35 days, including hemoglobin, hematocrit, etc. ResultsHemoglobin(Hb) concentration of group A decreased to 90 g/L and morphological features met the requirments. Hb in group B did not decrease; Hb in group C decreased a little but no less than 90 g/L. ConclusionThe formular A feed can establish iron deficiency anemia model successfully, formula B and C are not applicable for the model building.

Iron deficiency anemia; Wistar rats; Hemoglobin(Hb)

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0433-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.006

2016-08-02

丁广宇(1992-), 男, 硕士研究生, 研究方向: 方向为免疫药理学。E-mail: 1293032013@qq.com

沈龙海(1963-), 男, 硕士生导师, 研究方向: 免疫药理学与肿瘤药理。E-mail: shenlh28@163.com