大鼠脊髓全横断损伤后神经源性膀胱模型的建立及评估

元小红, 贺 丰, 江泽辉, 赵 赫, 叶 超, 伍绍明, 于海川, 李春根

(1. 北京中医药大学东直门医院骨二科，北京100700;

2. 天津中医药大学第一附属医院骨科，天津 300073)

大鼠脊髓全横断损伤后神经源性膀胱模型的建立及评估

元小红1, 贺 丰2, 江泽辉1, 赵 赫1, 叶 超1, 伍绍明1, 于海川1, 李春根1

(1. 北京中医药大学东直门医院骨二科，北京100700;

2. 天津中医药大学第一附属医院骨科，天津 300073)

目的 建立理想的脊髓损伤(SCI)后神经源性膀胱(NB)动物模型并评估脊髓及膀胱状态。方法 16只SD大鼠分为对照组(假手术)6只，实验组(T9脊髓全横断损伤大鼠模型)10只，记录每日实验组大鼠手法排尿量等情况以评估SCI后NB恢复情况，术后2周使用尿流动力学方法检测并比较两组大鼠膀胱内压以评估大鼠膀胱状态。结果 实验组大鼠术后1 d、5 d、10 d、13 d、14 d时尿量均明显高于对照组大鼠(P＜0.05)，术后16 d实验组大鼠尿量与对照组无差异(P＞0.05)。术后一周内, 大鼠手法辅助排尿量逐渐增加并达到最大。术后一周后, 大鼠辅助排尿量逐渐减低并于两周时渐渐稳定。对照组及实验组大鼠在最大膀胱压、膀胱基础压、排尿阈、收缩间隔、膀胱容量、排尿效率的参数值分别为26.60±4.31 mmH2O、21.66±2.56 mmH2O; 11.66±1.33 mmH2O、14.72±2.65 mmH2O; 20.46±0.52 mmH2O、16.99±0.81 mmH2O; 1.36±1.58 min、2.02±0.36 min; 0.82±0.15 mL、2.20±0.24 mL; 92.67%±1.97%、25.33%±4.46%，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论 采用T9水平脊髓全横断损伤制作的NB大鼠模型可操作性强，易量化、可重复，在正确积极的术后护理下并发症少、死亡率低。使用术后SCI大鼠手法排尿量的变化判断脊髓恢复情况，并以尿流动力学方法检测大鼠在膀胱连续灌注下的膀胱压力变化来评价其膀胱状态客观可行。

神经源性膀胱(NB); 脊髓损伤(SCI); 动物模型; SD大鼠; 膀胱内压

神经源性膀胱(neurogenic bladder，NB)是指控制排尿的中枢神经(脑或脊髓)或周围神经受到损害后引起的排尿功能障碍, 它是脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后的常见并发症, 易导致SCI患者低下的生活质量和较高的病死率[1,2]。SCI后NB是临床治疗难点, 因此建立理想的SCI后NB动物模型，对探索该病病理机制, 探求有效干预措施，防治尿失禁、肾损伤、尿路感染、结石等并发症发生的基础, 对提高SCI患者的生活质量具有十分重要作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级7周龄雌性SD大鼠16只，体质量200～220 g。由维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2012-0001], 饲养于北京中医药大学实验动物中心[SYXK(京)2011-0024]。所有大鼠实验前均适应性饲养1周。所有大鼠脊髓横断损伤模型制备均在北京中医药大学实验动物中心无菌操作下完成。

1.2 分组及造模方法

对照组6只, 假手术，仅作背部皮肤肌肉切开并咬开椎板后缝合; 实验组10只, T9脊髓全横断损伤大鼠模型，质量分数0.9 g/kg乌拉坦腹腔内注射麻醉大鼠后，俯卧位固定于平板上，常规备皮，体积分数75%酒精消毒背部手术区域，根据解剖学标志定位T10椎体。以T10棘突为中心沿背侧正中线做长约2 cm的纵行切口，依次切开皮肤及皮下组织，紧贴椎板切开竖脊肌并向两边钝性剥离，用撑开器撑开肌肉组织，显露相邻上下胸椎的棘突和椎板。用手术刀切开T9～T10棘间韧带，用微型咬骨钳自T9～T10椎板间隙紧贴椎板与脊髓平行进钳，轻轻向上小心咬除椎板，逐渐咬除整个T9椎板及两侧关节突，避免损伤脊髓硬脊膜、血管和神经根。尖刀片在显露的脊髓一端横向切断脊髓，刀尖要触及椎管前壁和侧壁骨面，反复切割脊髓，即可见大鼠双下肢抽搐，尾巴甩动并松驰，后以弯头显微镊轻轻抬起脊髓断端用显微剪剪断取出约1～2 mm长的脊髓组织，脊髓内缩形成一个空洞，以明胶海绵充分止血并清理切口后填充空洞，逐层缝合肌肉、皮下组织及皮肤。

1.3 术后护理

术后大鼠在加热毯上至苏醒后放回单笼饲养，每2日更换清洁、干燥垫料，保持笼内干燥。术后1周每日腹腔注射青霉素钠8万单位预防感染。实验组大鼠每日2次以手法对大鼠进行人工辅助排尿、排便，若大鼠下腹部毛发潮湿、脏色则以安尔碘擦拭以防褥疮和自噬。

1.4 膀胱功能评价

1.4.1 术后辅助排尿量 左手拇指与食指、中指形成环, 自上肢腋窝下水平稍用力抓住大鼠胸部, 使大鼠面向操作者, 右手握住大鼠盆部，右手拇指按压下腹部, 手法应轻柔, 用力合理, 以防挤爆膀胱。在此过程, 下方放置广口接尿杯, 手法挤压结束后，视具体情况分别倒入适应大小如5 mL、15 mL离心管以计量大鼠手法辅助排尿量(mL)(图1)。

图1 SCI大鼠手法排尿Figure 1 Manual urination of SCI rats

图2 SCI大鼠膀胱测压Figure 2 SCI rat cystometry

1.4.2 膀胱压力测定 造模2周后, 乌拉坦(0.9 g/kg)腹腔内注射麻醉大鼠后, 在下腹部中间纵行切开皮肤肌肉暴露膀胱, 在膀胱顶部避开血管以2.5 mL注射器针头扎1孔, 插入硬膜外导管用4-0针带线做荷包缝合固定, 导管从腹部引出并固定、以生理盐水浸润的纱布覆盖伤口让大鼠休息30 min左右。导管经三通管分别连接压力换能器、微量注射泵及注射器(图2)。将所有连接的管腔及压力换能器注满生理盐水, 保证其中没有任何气泡后压力换能器大气压调零。微量注射泵以0.1 mL/min的速度持续灌注生理盐水并使用配套数据采集软件(BIOPAC MP150 AcqKnowledge4.2)记录膀胱内压力变化曲线, 记录具体参数: 最大膀胱压(MP), 膀胱基础压(BP), 排尿阈(TP), 收缩间隔(ICI), 膀胱容量(BC)和排尿效率(VE)。

1.5 统计学处理

将所有数据输入Excel表格中, 运用 SPSS20.0统计软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组内、组间均数比较应用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

对照组情况良好。实验组大鼠在造模术后1 d死亡2只，其余全部存活。麻醉清醒后，其余实验大鼠均只能以前肢行走，后肢属于拖行状态不能参与行走，说明SCI大鼠造模成功。术后第1周实验组大鼠膀胱明显胀大，不能自行排尿, 给大鼠手法排尿时，有的大鼠刚被抓提即开始排尿，同时伴随排便障碍，有些可出现肠胀气; 活动减少，不思饮食，体质量明显减轻，部分大鼠后肢可出现严重红肿及褥疮。术后第2周实验组大鼠膀胱胀大不明显，可见下腹部及笼内垫料潮湿; 约2周后，大鼠后肢运动功能逐渐恢复。

2.2 排尿量

实验组大鼠术后1 d、5 d、10 d、13 d、14 d时尿量均明显高于对照组大鼠(P＜0.05), 术后16 d实验组大鼠尿量与对照组无统计学差异(P＞0.05)(表1)。

2.3 膀胱压力测定检查

与对照组相比，实验组大鼠的最大膀胱压(MP)、排尿阈(TP)较低，膀胱基础压(BP)较高，膀胱容量(BC)较大，收缩间隔(ICI)较长，排尿效率(VE)降低(均P＜0.05)(表2)。

表1 两组实验动物术后尿量Table 1 Comparison of manual urination output in the two groups of rats mL

表2 两组大鼠膀胱压力测定结果Table 2 Comparison of cystometric parameters in the two groups of rats

3 讨论

临床上，造成NB的病因繁多，包括脊髓与颅脑外伤、先天性疾病如神经管闭合不全、其他疾病或药物作用等，其中SCI是最常见的病因[3]。目前，SCI模型大致可分为脊髓挫伤、脊髓压迫损伤、缺血再灌注损伤、横断损伤、化学损伤和脊髓火器伤等。而1911年由Allen首次提出的重物坠击挫伤模型是制作大鼠SCI的主要方法。此方法的优点为较接近临床实际，然而此种方法损伤区域不恒定，瘫痪程度和持续时间不统一，并且存在部分动物术后脊髓功能恢复的情况，因此损伤后对于膀胱的影响不够稳定。根据SCI后NB的研究目的来看，本实验采用的脊髓横断损伤较为适宜。该方法将脊髓全部横断，手术操作简单、伤口整齐直观、损伤稳定、其瘫痪症状直接归因于脊髓横断损伤。本结果尚有不足之处，当大鼠脊髓被完全破坏后，继发性脊髓感染等并发症也随之增多，使得动物的术后护理更加困难。因此，脊髓全横断损伤后模型动物的护理成为降低模型动物死亡率的关键。在预实验的反复摸索中，作者认为术中应严格加强无菌操作，以可吸收性明胶海绵充分止血后留置明胶海绵填充脊髓缺损处，牢固缝合切口，术后1周每日注射青霉素钠，每日按时定点手法按摩排尿，经常更换垫料，保持卧处干燥柔软防褥疮等术后护理措施，都能增加SCI后NB动物模型的成功率。

本实验采取T9水平脊髓完全横断，既中断了上位排尿中枢对于膀胱的调控，又保留了骶髓排尿中枢及相应支配器官间神经反射的完整性。若损伤平面过高则可影响心血管系统和呼吸系统，增加动物术中死亡率; 若损伤平面过低可能会损伤骶髓的相关排尿中枢, 则影响因素较复杂不易控制。这与大多文献报道中，胸位脊髓横断法选用T8～T10节段相符，但本实验中采取直接切除T9节段约1～2 mm不同于大部分报道中为提高成活率以尖刀直接切断而不移除。本实验移除脊髓组织能够保证损伤的完全，并且在脊髓缺失的空洞处填充明胶海绵能够阻断脊髓一定的自愈。因此，大鼠T9水平完全横断损伤模型，手术操作简易，重复性好，损伤程度较恒定，解剖定位准确，成模率较高，适于研究上位排尿中枢损伤后的膀胱功能障碍的康复治疗。

SCI后NB主要存在三个问题: ①逼尿肌机能低下;②逼尿肌亢进; ③逼尿肌-括约肌协同失调(DSD)[4]。SCI后脊髓即进入休克期，横断面以下的神经活动消失，膀胱出现前两个问题，处于无反射、无收缩状态，尿液充盈，主要表现为尿潴留，有时出现严重的过度充盈而发生充盈性尿失禁[5,6]。同时当脊髓反射逐渐恢复，脊髓内控制膀胱的神经开始恢复活动，由于失去了横断面以上的神经控制，故此时膀胱的脊髓内神经控制出现紊乱，表现为逼尿肌-尿道括约肌失调，膀胱呈痉挛性，出现贮尿和排尿功能的双重障碍。实验组大鼠在术后立即出现尿潴留，大鼠的尿量变化符合SCI后NB脊髓休克期及休克恢复期膀胱排尿功能变化的趋势。而本实验中未观测到脊髓休克恢复期后典型的反射性尿失禁，这说明对于膀胱支配神经的破坏已完全。因此，据术后大鼠尿量的变化及统计结果表明，术后7 d内为脊髓休克期，术后7-14 d为脊髓休克恢复期，并且术后14 d后宜开始干预措施。这将为进一步研究介入治疗的干预时间选择提供依据。

尿动力学检查是膀胱和尿道疾病诊断中一个非常重要的方法[7]，被国际尿控协会定义为“是对下尿路的生理和尿液运动流体力学的研究”[8]。小动物(如大鼠)的尿动力学检查，是研究排尿期障碍病理生理学及下尿路药物作用的基础。鉴于条件的限制及动物生理特点等原因，本实验只选取膀胱内压测定用于评价膀胱功能的变化。实验显示, 术后2周时，膀胱基础压高而排尿阈及最大膀胱压下降，表明SCI大鼠储尿和排尿功能均出现了障碍，造成较低的排尿效率。如前所述，术后2周则SCI大鼠主要表现为DSD，痉挛性膀胱; 而长期的尿潴留引起膀胱壁充血、水肿等炎症反应，导致膀胱壁增生，膀胱容量增大。这与SCI后NB的生理病理过程相符合的,也与报道中相关尿动力学检查结果相一致[9,10]。

综上所述，本研究参考大量国内外文献，并经过反复的预实验，采取的脊髓全横断损伤制作NB模型，重复性好，损伤恒定，定位明确。而且总结出较完备的动物术后护理，降低死亡率及并发症的发生率，提高了动物的成模率。通过术后SCI大鼠手法排尿量的变化判断出术后7 d内为脊髓休克期，术后7～14 d为脊髓休克恢复期，为进一步研究介入治疗的干预时间选择提供依据。通过比较两组大鼠的尿流动力学参数评估其膀胱状态证实模型成功，为膀胱重建的研究提供了一定的基础。

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Establishment and Evaluation of Rat Model of Neurogenic Bladder after Spinal Cord Transection Injury

YUAN Xiao-hong1, HE Feng2, JIANG Ze-hui1, ZHAO He1, YE Chao1, WU Shao-ming1, YU Hai-chuan1, LI Chun-gen1
(1. Second Department of Orthopaedics, Dongzhimen Hospital Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; 2. Department of Orthopaedics, The First Hospital Affiliated to Tianjin University of Chinese Medicine, Tianjin 300073, China)

ObjectiveTo establish the ideal animal model of neurogenic bladder (NB) after spinal cord injury (SCI) and evaluate and the state of the bladder.MethodsSixteen female SD rats were divided into control group and the experimental group (T9 spinal cord transection injury model), according to the record of the daily manual urination output to evaluate the NB recovery after SCI. After two weeks the simultaneous recording of the intravesical pressure were used to detect, compare and assess the state of bladders in two groups.ResultsThe urine output of experimental rats at first day, 5thday, 10thday, 13thday, 14thday after operation were significantly higher than thoes of control group rats (P＜0.05), and the urine output of experimental rats at 16thday after operation was no statistically significant difference with control group (P＞0.05). During a week postoperation, the daily manual urination output increased and reached maximum. One week later postoperation, the daily manual urination output was on the gradually decrease and stable for two weeks. The values of the parameters of the maximum bladder pressure, the basis bladder pressure, voiding threshold, bladder capacity, voiding efficiency in control group and experimental group respectively were 26.60±4.31 mmH2O and 21.66±2.56 mmH2O, 11.66±2.33 mmH2O and 14.72±2.56 mmH2O, 20.46±0.52 mmH2O and 16.99±0.81 mmH2O, 1.36±1.58 min and 2.02±0.36 min, 0.82±0.15 mL and 2.20±0.24 mL, 92.67%±1.97% and 25.33%±4.46%, the differences were statistically significant (P＜0.05).ConclusionThe NB rat model of T9 level spinal cord transection injury with a strong maneuverability and easy to quantify, repeatable. With the correct postoperative nursing care, there were fewer complications and low mortality. The recording of daily manual urination output and the intravesical pressure can be the good ways to detect the spinal cord recovery and evaluate the status of the bladder.

Neurogenic bladder (NB); Spinal cord injury (SCI); Animal models; Sprague-Dawley rats; Cystometric

Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0423-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.004

2016-07-06

元小红(1987-), 女, 博士研究生, 研究方向: 脊髓损伤与关节软骨修复。E-mail: zhenjiuyuan@126.com

李春根, 主任医师。E-mail:leechungen@126.com