三种处理方法对兔慢性骨髓炎病灶骨杀菌效果初探

孔庆柱, 杨佳宁, 王贺龙, 赵胜军, 孔素红, 赵佳林, 金 宇(承德医学院附属医院创伤小儿骨科, 承德 067000)

三种处理方法对兔慢性骨髓炎病灶骨杀菌效果初探

孔庆柱, 杨佳宁, 王贺龙, 赵胜军, 孔素红, 赵佳林, 金 宇
(承德医学院附属医院创伤小儿骨科, 承德 067000)

目的 研究蒸馏水煮沸、碘伏冲洗及抗生素冲洗三种方法对感染金黄色葡萄球菌兔胫骨慢性骨髓炎的杀菌效果。方法 建立兔胫骨慢性骨髓炎模型，将模型兔随机分成3组，分别截取病骨，然后编号，做不同处理。A组: 用碘伏原液冲洗30 min; B组: 蒸馏水煮沸30 min; C组: 抗生素(对金葡菌敏感)冲洗，随机取部分处理后的病骨分别进行细菌学培养, 放置于标准培养皿培养48 h，综合两者结果，以髓腔内容物病理学检测及培养后菌落数为金标准，比较3种方法的杀菌效果。结果 1)3组处理方法均不会对病骨造成质破坏，均能保持良好的形态相容性; 2)高倍镜下观察3组培养基平均菌落数: 蒸馏水组＜碘伏组＜抗生素组; 3)病理学检测，蒸馏水煮沸组无明显成骨细胞，处理后几乎成为死骨组织。结论 3种不同方法对兔胫骨慢性骨髓炎都有灭菌效果，碘伏浸泡方法更具优势。

慢性骨髓炎; 兔; 煮沸; 碘伏; 抗生素

慢性骨髓炎(chronic osteomyelitis, CO)是骨组织的慢性感染, 可源于血液细菌种植、局部软组织感染, 也可源于创伤时细菌直接种植导致的急性骨组织感染, 特别是现代社会节奏快, 外伤、交通事故伤等高能量损伤较以前更为常见[1], 导致CO的发生率有所上升，且治疗难度更是居高不下。另一方面，在偏远地区或地方小医院, 通常因急救意识缺乏或薄弱、清创不彻底而形成死骨、窦道、死腔及病变肉芽组织易导致CO反复发作。目前临床上普遍公认对于CO治疗方法为彻底清创、髓腔含抗生素液体灌洗疗法以及全身静点抗生素4～6周, 但这种方法需要高的血药浓度为基础; 其他改良方案包括病灶清除+置管持续冲洗及彻底病灶骨清除后, 抗生素链骨髓泥填塞。但临床上结果往往是由急性骨髓炎转变为CO或CO反复发展, 迁延不愈, 病程时间可以持续数月甚至数年, 且反复发作。有报道[2,3]复发率达20%～30%, 且容易伴随致病菌反复感染及细菌耐药[4]。对个人及家庭造成严重的心理及经济负担以及医疗资源的大量浪费。本实验在确诊为兔CO胫骨模型成功的条件下, 比较碘伏浸泡、蒸馏水煮沸及抗生素冲洗3种不同的灭菌效果, 为临床上对治疗CO尤其是在彻底清创后灭菌方法的选择上提供可靠根据[5], 从而可减少CO漫长治疗时间。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级新西兰白兔100只，2～3月龄，体质量2～2.5 kg, 雄性44只，雌性56只，由承德医学院实验动物中心提供[SCXK(冀)2015-0100], 饲养于清洁级环境下(承德医学院动物实验中心)[SCXK(冀) 20014-0012]。

1.2 菌株、试剂和仪器

金黄色葡萄球菌，菌株ATCC29523， 承德医学院附属医院检验科室提供; 5%鱼肝油酸钠，上海金珠药业有限公司; 解剖常规器械，河北承德附属医院动物中心实验室; 标准比浊管等。

1.3 兔胫骨骨髓炎模型制作

参考闻一新等[6]方法制备兔胫骨慢性骨髓炎模型: 新西兰白兔术前适应性饲养2周，用3%戊巴比妥液按1 mL/kg在耳缘静脉注入, 麻醉满意后, 右侧胫骨备皮后, 取内侧纵长约4 cm切口, 钝性剥离约2 cm×2 cm大小的骨膜，制成一个约1 cm× 1 cm的圆形的骨缺损即骨窗; 取培养完毕后的金黄色葡萄球菌用接种环将菌体刮下，选取标准比浊管作为浓度标准参考物, 参考6号标准管(106cfu/mL),用滴定管吸取质量分数0.9%生理盐水予以滴定，制成浓度为1×106cfu/mL金黄色葡萄球菌液1 mL,用一次性滴定管吸取0.5 mL金黄色葡萄球菌液从骨窗内向髓腔内沿远近端注入，再向骨窗内沿远近端注射0.5 mL的5%鱼肝油酸钠，逐层缝合皮肤。待麻醉效果消失后回笼常规喂饲养。此整个过程中因麻醉致死2只，术后细菌感染死亡3只，术后4周均出现不同程度发热, 精神差, 进食少等骨髓炎后的临床表现, 依据: ①拍X线片观察到90只兔右胫骨手术部位有慢性化脓性骨髓炎表现: 骨质破坏，增生的骨痂，且有死骨形成(图1A)与未成功造模有明显区别(图1B); ②肉眼观察均呈现出局部软组织肿胀，可伴有破溃; 检测表明90只兔均满足要求, 可作为兔胫骨骨髓炎模型做下一步实验。

1.4 模型兔分组及处理

将造模成功的90只兔随机分为随机标90个号码，应用空气栓塞法处死兔后分别取出右胫骨骨髓炎病骨, 每段都包含着病变胫骨及肉眼观察无明显改变的胫骨0.5 cm，总共90例，采用随机数表法,分为A、B、C三组, 每组30例。整个过程严格遵守随机分配原则。A处理组: 取1个100 mL烧杯倒入50 mL蒸馏水, 蒸馏水达到沸点, 接着将A组的30例CO兔胫骨截取2 cm, 要求完整包含病骨的胫骨且要部分正常骨组织, 分别置于50 mL蒸馏水的烧杯中30 min。依照此法重复B处理组: 取30个无菌换药包, 将新启碘伏原液倒满无菌弯盘内, 按上诉方法截取病骨, 置入无菌弯盘内, 反复充分冲洗约30 min, 完毕后用质量分数0.9%生理盐水100 mL彻底冲洗, 立即取标本做细菌学培养实验; C处理组:取出病骨后, 使用8万单位庆大霉素溶于500 mL生理盐水制成抗生素溶液, 1～3 d每日冲洗6 L, 3～9 d冲洗3 L, 10～14 d冲洗1.5 L, 充分灌洗病骨, 取最后一次冲洗完后病骨应用0.9%生理盐水冲洗，各取标本，与其他2组一样行细菌培养及病理学检查。

1.6 细菌培养

标本取自病变局部渗出物、脓液或处理后病灶骨碎屑, 无菌技术取材后立即送细菌室( 间隔时间不超过2 h)。常规培养皿35 ℃恒温箱内培养48 h。

1.7 病理学检查

处理后的标本制成切片后立即做病理学检查。

图1 兔胫骨X线片

1.8 观测指标

大致观测: 观察三组处理完后兔胫骨有无破损、皮质断裂等，确定3种处理方法对其有无物理破坏; 细菌学培养: 3个组实验兔病骨周围组织于标准培养环境下培养48 h，在单位面积下观察菌落数，以此为金标准; 病理学检测: 3组实验兔病骨周围组织进行病理学检测，根据各组病理检查结果比较3种不同方法灭菌效果。

1.9 统计方法

采用 SPSS 19.0统计软件, 计量数据以均数，标准差±s描述, 组间比较采用t检验, P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察

三组方法处理后, 均未出现骨质破坏, 均能保持较好的形态, 与原胫骨均有很好的形态相容性。

2.2 细菌学培养

A组骨缺损周围组织细菌培养结果都为阴性，阳性率为0%，B组细菌培养结果4例阳性，阳性率为13.33%(4/30)。C组11例为阳性，其余均为阴性，阳性率为36.67%(11/30)，两两比较差异均有显著性(t 值分别为4.29, 13.47和4.35, P＜0.05)。

图2 兔胫骨病理学观察

2.3 病理学观察

A处理组在HE染色下(图2A)显示全为死骨形成, 个别标本可见少量成骨细胞，未见嗜酸性粒细胞等炎症细胞存在，死骨形成区域呈片状或条带状，成骨细胞呈零星点状分布，未见明显分布规律; B处理组在HE染色下(图2B)有4例标本表现为大块区域的嗜酸性粒细胞浸润，面积较大, 组织轻度水肿，其余标本中未见明显炎症细胞浸润, 且成骨细胞较多且密; C处理组在HE染色下(图2C), 其中11例可见大面积中性粒细胞及炎症细胞浸润，面积较B组大，覆盖区域更广伴部分死骨形成，少量成骨细胞呈点状存在。正常骨组织未见明显炎细胞浸润影, 组织间无水肿(图2D)。

3 讨论

临床上因CO迁延难愈、反复发作、易于耐药，被人称作“不死癌症”，近年来发病率有上升趋势[7], 清创后抗生素灌洗是此病的经典治疗方法，国内外专家对CO开展了很多研究，提出过许多治疗思路及方式: 从全身用药到局部应用，药物治疗和冲洗、肌瓣填塞、骨搬移等特殊手段的联合应用，到目前为止效果均欠佳[7]。目前临床应用抗生素冲洗已趋于淘汰[8]，人们逐渐关注使用碘伏，因为碘伏灌洗可在短时间内渗入死腔、病骨及周围瘢痕组织，快速、彻底杀灭残存其中的细菌，更能突破应用抗生素治疗所不能破坏的“细菌保护伞”，形成杀菌膜，通过产生游离碘，进而细胞膜被氧化而失活。此外碘伏对局部组织如神经、肌肉、血管等无明显刺激和破坏，但碘伏对正常生物组织仍有一定的毒性作用[9]。本实验结果显示碘伏具有良好的杀菌效果，且病灶骨依然具有良好的成骨能力，特别是CO的中后期往往病灶骨较大，CO病骨杀菌原位移植技术可以发挥巨大作用。贝朝涌等[10]在研究感染骨灭活原位移植治疗CO中，提到感染骨灭活原位移植后移植骨与截骨断面间隙有血管长入，散在发育骨小梁和大量软骨细胞团形成。上述学者结论再结合本次实验，可知煮沸杀菌法固然具备极强的杀菌能力，但不可避免造成大量死骨，不利于后期骨折愈合，从而不能达到治疗目的；碘伏浸泡杀菌虽比不上煮沸，但是较应用抗生素效果明显，细菌阳性率明显降低，而且HE染色下观察骨组织依旧能有较强的成骨能力，无明显组织水肿表现。

本实验通过对比煮沸、碘伏浸泡及抗生素冲洗3种方法杀菌效果，综合处理后病灶骨成骨能力及对软组织损伤程度等因素，得出碘伏浸泡可以达到满意杀菌效果同时尽可能保留骨组织成骨能力，对治疗骨髓炎具有良好的应用潜力。故而碘伏浸泡杀菌法在临床上有较大的发展空间及应用价值。

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Q95-33

B

1674-5817(2016)06-0447-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.009

2016-07-22

河北省承德市科技局支撑项目(201422036): 病灶灌洗联合自体病骨灭菌原位移植治疗慢性骨髓炎的实验研究

孔庆柱(1981-), 男, 硕士, 主治医师。E-mail: kongqingzhu0314@163.com

金 宇, 男, 硕士, 主任医师E-mail: 158336871@qq.com