腹泻树鼩肠道阿米巴原虫携带情况调查

宋庆凯, 苗雨润, 尹博文, 陈玲霞, 代解杰, 孙晓梅

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心,

云南省重大传染病疫苗研发重点实验室, 昆明650118)

腹泻树鼩肠道阿米巴原虫携带情况调查

宋庆凯, 苗雨润, 尹博文, 陈玲霞, 代解杰, 孙晓梅

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所树鼩种质资源中心,

云南省重大传染病疫苗研发重点实验室, 昆明650118)

目的 调查腹泻树鼩肠道中阿米巴原虫携带情况，查找可能导致树鼩腹泻的寄生虫类病原，为实验树鼩的寄生虫质量控制提供依据。方法 采集78只腹泻树鼩新鲜粪便和全血，分离血清，其中野生来源样本45份，人工繁育样本33份。分别采用生理盐水涂片法、碘液染色法进行阿米巴原虫形态学检测，采用ELISA方法进行粪便中阿米巴抗原和血清中IgG抗体检测。结果 形态学镜检结果显示，野生来源和人工繁育腹泻树鼩肠道中阿米巴原虫携带率分别为42.22%(19/45)、33.33%(11/33); 经ELISA检测粪便中阿米巴抗原，阿米巴原虫携带率分别为64.44%(29/45)、42.42%(14/33)。采用ELISA粪便抗原检出率高于形态学镜检法。经ELISA检测血清IgG抗体阳性率分别为66.67%(30/45)、63.63%(21/33)。结论 腹泻树鼩对阿米巴原虫的携带率较高，该原虫可能是导致树鼩腹泻的病原之一。日常饲养过程中应加强阿米巴病的监测和防治，防止肠道寄生虫病的传播。

树鼩; 阿米巴原虫; 形态学检测; ELISA检测

树鼩(Tupaia belangeri)作为与灵长类动物亲缘关系最近的新型模式动物，在人类疾病模型尤其是感染性疾病模型研究中发挥着不可或缺的作用，已逐步成为生物医学研究的热点[1]。然而迄今为止，有关树鼩寄生虫的感染种类、感染程度、致病性以及防治等方面的研究报道比较有限，这极大的阻碍了树鼩成为标准化实验动物的进程，也使研究结果的可靠性和可重复性受到影响，限制了树鼩在疾病机理研究和药物研发中的更深层次的应用[2,3]。因此对树鼩携带的寄生虫进行更加全面和深入的研究迫在眉睫。前期研究表明，树鼩对原虫具有较高的感染率，陈玲霞[4]等曾报道树鼩携带有大量的鞭毛虫，在日常饲养中作者也见到树鼩经常出现腹泻的情况, 并在粪便显微镜检查中经常观察到类似于阿米巴形态的原虫。为进一步证实这一事实而开展本次研究。

肠阿米巴病(intestinal amebiasis)主要是由溶组织内阿米巴寄生在结肠内，引起阿米巴痢疾或阿米巴结肠炎的一种人兽共患寄生虫病[5-7]。该病分布范围广，易感动物较多，呈世界性流行传播，其病死率在原虫寄生虫病感染中仅次于疟疾[8]。当动物机体感染致病性阿米巴原虫后,可出现侵袭性的症状，也可处于一种无症状的带虫状态。树鼩作为实验动物，那些受感染的个体有可能成为潜在的阿米巴病的传染源,影响其他动物甚至人类的健康。因此,有必要对树鼩进行阿米巴原虫的流行病学调查，为探明腹泻病原、制定树鼩质量标准和质量监测提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

野生来源成年树鼩45只，在普通级环境设施中仅饲养了3个月，体质量120～150 g, 人工繁育的树鼩33只, 年龄为3～4月龄, 体质量90～110 g,为刚离乳的幼树鼩，实验树鼩均由医学生物学研究所树鼩种质资源中心提供[SCXK(滇)K2013-0001]。树鼩在日常观察中常伴有腹泻症状，少数出现酱色样粪便。实验操作在医学生物学研究所树鼩种质资源中心实验设施进行[SYXK(滇) K2013-0001]。

1.2 仪器及试剂

Eclipse 80i Nikon 显微镜，SMZ1500 Nikon 体视镜(日本)，Power WaveXS2酶标仪(美国)，Forma恒温培养箱(美国)，CT15RE 低温离心机(日本)。人阿米巴IgG抗体(Amebiasis IgG)、人阿米巴抗原(Amebiasis Ag)酶联免疫分析试剂盒(购自上海酶联生物科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 粪便标本: 抓取并保定树鼩，多数树鼩在抓取过程中因紧张而主动排出粪便，对无粪便者可轻轻按摩其腹部使其排便。每只采取豌豆粒大小新鲜粪便标本。

血液标本: 抓取并保定树鼩, 尾静脉采集0.2 mL血液置于1.5 mL无菌离心管中, 然后放在37 ℃孵箱中30 min, 4 ℃冷藏4 h, 3 500 r/min离心10 min，小心分离最上层血清于干净无菌离心管。

1.3.2 光学显微镜检查 直接涂片法: 加1～2滴生理盐水于洁净的载玻片中央，挑取标本，在生理盐水中涂抹成粪便膜，厚度以透过粪便薄膜能看清字为宜，加盖玻片后显微镜下观察。

碘液染色法: 可疑样本用碘液染色, 制片方法同直接涂片法, 检测是否存在阿米巴原虫包囊或滋养体。

1.3.3 ELISA粪便抗原检测法 应用双抗体夹心法测定标本中人阿米巴抗原(Amebiasis Ag)表达情况。在1.5 mL离心管中加入200 μL样品稀释液，取固态粪便约50 mg置入稀释液中混匀(若液体粪便则取100 μL)，静置数分钟后，取上清液直接用于检测。操作程序和结果判断按试剂盒说明书进行。

1.3.4 ELISA血清抗体检测法 应用双抗原夹心法测定标本中人阿米巴IgG抗体(Amebiasis IgG)的表达，用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度(A 值)，操作程序和结果判断按试剂盒说明书进行。

2 结果

2.1 形态学检测结果

形态学观察多见包囊，呈圆球形，直径为5～20 μm，细胞质呈泡沫状，多数囊内含核1～4个。图1A所示为树鼩粪便中典型4核包囊形态，内还有大小不等两端钝圆的棒状拟染色体，经碘染后包囊呈淡黄绿色。少数样本中能观察到滋养体，大小30～50 μm，内外质分界明显，外质较透明，内质呈颗粒状，一般含有1核。伪足呈宽指状，运动活跃，内含吞噬的红血球。图1B为碘染的滋养体形态。通过显微镜观察野生来源和人工繁育腹泻树鼩粪便45份、33份，阿米巴原虫携带率分别为42.22%(19/45)、33.33%(11/33)。

图1 碘液染色法Figure 1 Iodine-stain smear

2.2 ELISA粪便抗原检测结果

阿米巴原虫携带结果见表1。

2.3 ELISA血清IgG抗体检测结果

阿米巴原虫抗体阳性率结果见表1。

表1 2种抗原检测方法及IgG抗体检测结果Table 1 The results of two kinds of antigen and IgG antibody detection

3 讨论

寄生于机体消化道内的阿米巴原虫种类很多,有溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica，E.h)、迪斯帕内阿米巴(Entamoeba dispar)、结肠内阿米巴(Entamoeba coli)、哈门氏内阿米巴(Entamoeba hartmanni)、微小内蜒阿米巴(Entamoeba nana)和齿龈内阿米巴(Entamoeba gingivalis)等, 但是只有E.h具有致病性，在宿主免疫力低下时，可引起急性暴发性阿米巴肠病，并可侵犯肝、肺、脑等其他器官，引起肠外阿米巴病[9]。调查结果显示，腹泻树鼩肠道中多有阿米巴原虫的存在，且携带率较高，说明阿米巴原虫尤其是其中的溶组织内阿米巴可能是引起树鼩腹泻的病原，这与它的栖息环境和食性密切相关[10]，因为野生来源树鼩主要生活在村落附近灌木丛林，喜食昆虫，很有可能因食用含有成熟包囊的粪便污染食物、饮水而感染。因此，对腹泻树鼩开展阿米巴原虫携带情况调查和检测方法研究，对指导阿米巴原虫监测与防治提供依据是非常必要。

本文采用直接涂片和碘液涂片法作为检测肠道阿米巴原虫的首选方法，这也是临床上该病原检测的金标准。虽然该法简单易操作, 但存在两方面的不足：其一是仅从形态学上不易区分致病性的阿米巴与非致病性阿米巴[11,12]，其二是检出率低。针对不同阿米巴原虫包囊形态容易混淆的问题，今后将进一步开展对阿米巴原虫的PCR检测[13]，可根据阿米巴原虫的SSU-rRNA 序列设计引物，进行巢式PCR扩增，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，并对阳性产物进行测序最后进行序列比对分析，从分子生物学的角度进一步验证。针对镜检率低的问题，联合采用ELISA试剂盒进行粪便中抗原检测，并检测了血清中IgG抗体以进一步获得可靠的数据。两种抗原检测结果对比显示，ELISA法检测粪便中的抗原阳性检出率大于镜检结果，说明镜检容易漏检。虽然镜检方法操作简单、经济实惠，但检测过程耗费时间较长且需要检测人员具备一定的筛查经验，不适合进行大规模的筛查活动，相比而言ELISA粪便抗原检测法检出率更高且方便快捷，更适合对树鼩种群进行大规模的溶组织阿米巴的筛查。此外，ELISA法检测血清阿米巴抗体可作为检测阿米巴病的辅助诊断方法，IgG抗体在阿米巴感染一段时间后仍持续存在，故而检出率相对抗原检测方法更高。

结合三种方法的检测结果分析，树鼩阿米巴原虫的携带率较高。究其原因是由于阿米巴原虫的传播性较强，野生来源树鼩在野外就已经感染，并且一旦感染, 在不借助药物治疗的情况下难以根除。野外树鼩引入实验室后人工繁育的子代仍然存在较高的携带率，一方面由于仔树鼩免疫系统尚未完善，而且阿米巴病为条件致病，在自身免疫力低下的情况下更易感，另一方面与受感染的母亲共同生活在同一环境增加了被感染几率。

本研究结果提示，为了更好降低阿米巴原虫的携带率，减少由致病性阿米巴原虫导致的腹泻疾病发生，在树鼩饲养过程中可根据实际情况定期添加抗原虫药物来进行防治; 同时应加强树鼩生活环境的清洁消毒工作，按时清洗树鼩饮用水盒料盒，阻断传播途径; 同时，定期通过多种方法综合监测，以降低阿米巴病原对实验树鼩的危害。

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Survey on Intestinal Amoeba in Diarrhea Tree Shrews

SONG Qing-kai, MIAO Yu-run, YIN Bo-wen, CHEN Ling-xia, DAI Jie-jie, SUN Xiao-mei
(Center of Tree Shrews Germplasm Resources, Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infection Diseases, Kunming 650118, China)

Objective To investigate the infection status of intestinal Amoeba in diarrhea tree shrews from the center of germplasm resources, to find out the cause of diarrhea, and to provide useful reference and support for prevention and treatment of parasitic infection in tree shrews. MethodsTotally 78 samples were collected from the fecal and blood of diarrhea tree shrews, and then were detected by the normal saline direct smear method and iodine solution staining, meanwhile stool antigen and IgG antibody in serum were detected by ELISA of Amoeba.ResultsThe results showed that the positive infection rate were 42.22%(19/45) of wild tree shrews, 33.33%(11/33) of breeding of tree shrews by direct smear and iodine staining method. The infectious rates of E. histolytica were 64.44%(29/45) and 42.42%(14/33) respectively when detected the stool antigen by ELISA. The positive rate of Amoeba IgG were 66.67% (30/45) and 63.63%(21/33) by ELISA detection.ConclusionsAmoeba infection rate is rather high in tree shrews, and it may be one of the pathogens of diarrhea tree shrews. In routine breeding should be strengthened in the process of testing control the spread of the parasite.

Tree shrews; Amoeba; Morphological detection; ELISA detection

R33 Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0415-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.002

2016-07-16

国家科技支撑计划(2014BAI01B01), 云南省联合支持国家计划项目(2015GA009)

宋庆凯(1991-), 男, 硕士, 研究方向: 实验动物病原学研究。 E-mail: 869188548@qq.com

孙晓梅(1963-), 女, 主任技师。E-mail: sxm@imbcams.com.cn