小鼠在柯萨奇病毒A组16型活病毒免疫原性评价中的应用

孟华清, 杨 婷, 谢天宏, 李 华, 岳 磊, 宋 霞, 张 也, 谢忠平

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118）

·论 著·

小鼠在柯萨奇病毒A组16型活病毒免疫原性评价中的应用

孟华清, 杨 婷, 谢天宏, 李 华, 岳 磊, 宋 霞, 张 也, 谢忠平

(中国医学科学院/北京协和医学院医学生物学研究所云南省重大传染病疫苗工程技术研究中心,云南省重大传染病疫苗研发重点实验室，昆明 650118）

目的 评价小鼠在柯萨奇病毒A组16型(CA16)活病毒感染中免疫原性的应用，为减毒活疫苗研究提供实验数据。方法 以不同剂量的CA16活病毒通过皮下、腹腔和肌肉途径接种不同年龄的ICR和BALB/c小鼠，采集初次免疫7 d、21 d、28 d以及加强免疫7 d后的血样; 通过微量细胞病变中和法检测中和抗体效价, 细胞因子ELISA检测试剂盒检测6种细胞因子含量。结果 初次免疫后28 d，肌肉、腹腔和皮下途径免疫的小鼠血清抗体阳转率分别为83.33%、40.00%和0.00%，抗体几何平均效价(GMT)分别为1∶169、1∶32和0; 加强免疫后，肌肉、腹腔和皮下途径免疫的小鼠血清抗体阳转率均达100%，抗体GMT分别为1∶813、1∶609和1∶32，肌肉和腹腔途径免疫的小鼠血清抗体GMT平均增长4.8倍和19.0倍; 加强免疫7 d的抗体阳转率达100%;明显高于初次免疫28 d和21 d; BALB/c小鼠与ICR小鼠相比，前者的中和抗体效价和抗体阳转率明显高于后者, 而小鼠年龄对中和抗体效价和抗体阳转率的影响不显著(P＞0.05); 免疫剂量对中和抗体效价和抗体阳转率的影响显著(P＜0.05), 高剂量病毒免疫小鼠后中和抗体效价和抗体阳转率明显比低剂量高(P＜0.05); 细胞因子检测结果显示加强免疫7 d后的白细胞介素10(IL-10)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量与初次免疫7 d的相比显著增加。结论 BALB/c和ICR小鼠可做为CA16活病毒免疫原性评价的动物模型，以4～6周龄的BALB/c小鼠最为敏感。

柯萨奇病毒A组16型(CA16); 免疫原性; 细胞因子; 减毒活疫苗

柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus group A tape 16, CA16)是引起手足口病(hand, foot and mouth disease, HFMD)的主要病原体之一，属于小RNA病毒科(Picornaviridae); 肠道病毒属(Enterovirus)。与另一种引起手足口病的病原体-人肠道病毒71型(Entrrovirus 71, EV71)相比，CA16引起的手足口病症状相对较轻，所导致的重症比例和死亡比例也相对较低, 但该病毒亦有较强的传播力[1]。近年来, 多个国家和地区相继有CA16引起的HFMD报道，并且CA16感染也能导致重症和死亡[2-5]。目前针对HFMD的另一主要病原体EV71的疫苗已批准上市。但是，单一的疫苗不能解决2种病毒共同传播感染且均能诱发严重并发症的问题，因此研发CA16疫苗尤为必要。评价疫苗的免疫原性是疫苗研发中的一个重点，目前一般采用婴猴做为动物模型，但成本较高，所以迫切的需要建立完善的CA16免疫原性评价的小动物模型。

作者将本实验室筛选出的CA16疫苗候选株病毒分别感染ICR、BALB/c小鼠, 测定中和抗体效价、细胞因子等指标, 分析品系、年龄、免疫途径、免疫剂量以及免疫程序对中和抗体效价的影响, 为进一步的疫苗研发和评价提供一定的实验数据基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级ICR、BALB/c小鼠(4周龄、6周龄、8周龄)由本所灵长类中心小动物实验部提供[SCXK(滇)K2014-0002]，饲养于清洁级设施[SYXK (滇) 2010-007]。

1.2 试剂、病毒与细胞

细胞因子ELISA检测试剂盒，由美国R&D Systems Inc.公司提供; CA16活病毒由昆明地区HFMD临床疑似患者样品分离而得(已鉴定)，由本科室保存。非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、人胚肺二倍体细胞(KMB17细胞), 由本所质量检定室提供。

1.3 实验性疫苗制备

取传代培养后生长状态良好的致密单层KMB17细胞，弃细胞培养液，接种适量病毒液，置于37 ℃培养箱中吸附1.5 h后，加入细胞维持液，于37 ℃温箱培养至细胞病变达75%以上时，收获病毒，并且采用微量细胞病变法检测病毒的感染性滴度为6.62 LgCCID50/mL，于-30 ℃冻存。

1.4 动物免疫

将CA16病毒收获液做倍稀释，稀释后病毒感染性滴度为5.62 LgCCID50/mL。分别用病毒收获液和病毒稀释液通过腹腔、肌肉和皮下免疫小鼠(4周龄、6周龄和8周龄)，0.5 mL/只，5只/组，对照组注射等量的生理盐水。初次免疫28 d进行加强免疫，剂量和途径与初次免疫相同。采集初次免疫21 d、28 d和加强免疫7 d后的血清和血浆，于-80 ℃冻存。

1.5 血清中和抗体检测(体外微量细胞病变中和法)

将血清于56 ℃水浴箱灭活30 min; 用稀释液进行2倍系列稀释, 加至96孔细胞培养板中, 50 μL/孔;将CA16活病毒稀释到2 000 LgCCID50/mL，加至96孔细胞培养板中，50 μL/孔，于37 ℃中和90 min。将长成单层致密的Vero细胞消化，制备成细胞悬液(细胞浓度约为1×105个/mL)，在所有孔种加入准备好的细胞悬液, 100 μL/孔, 于37 ℃、5%CO2培养箱中静置培养, 每日观察并记录细胞病变体积分数情况，第7日判定结果。以中和抗体效价≥1∶8判为阳性。

1.6 血浆细胞因子检测

取小鼠初次免疫7 d与加强免疫7 d以及阴性对照的血浆采用小鼠细胞因子ELISA检测试剂盒分别检测各细胞因子水平。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 免疫途径对中和抗体效价的影响

不同途径免疫ICR小鼠, 检测免疫血清的中和抗体效价, 初次免疫后28 d, 肌肉、腹腔和皮下途径免疫获得的血清中和抗体几何平均效价(GMT)值分别为: 1∶169、1∶32、0。肌肉注射组明显高于其他两组(P＜0.05), 加强免疫后7 d，肌肉、腹腔和皮下三个免疫途径的GMT值分别为1∶813、1∶609、1∶32。肌肉与腹腔免疫结果相近而且略高于皮下组(P＞0.05, 图1)，肌肉免疫实验组的中和抗体阳转率在初次免疫28 d时高于皮下免疫和腹腔免疫实验组的中和抗体阳转率(表1)，而加强免疫后各免疫途径组的阳转率均达到100%。

图1 不同免疫途径的中和抗体效价

表1 免疫途径与中和抗体阳转率之间的关系

2.2 免疫时间对中和抗体效价的影响

在初次免疫28 d后进行加强免疫, 比较初次免疫21 d、28 d, 加强免疫7 d后3个时间点的血清中和抗体效价, 阴性对照组的小鼠血清在以上3个时间点都不能检测出能中和CA16病毒的中和抗体，结果加强免疫7 d后的血清中和抗体效价明显高于初次免疫21 d与28 d的抗体效价(P＜0.05, 图2)，其中初次免疫28 d的血清中和抗体效价同样比初次免疫21 d的高，这也能够说明21 d的小鼠血清中和抗体效价未能达到最高水平，而随着时间的延长抗体效价也相应增高; 并且BALB/c小鼠整体的中和抗体效价在初次免疫21 d、28 d以及加强免疫7 d后都要比ICR小鼠的效价高，说明BALB/c小鼠比ICR小鼠对CA16病毒敏感。采用卡方检验比较免疫时间对阳转率的影响，结果显示免疫时间对阳转率的影响具有统计学意义(P＜0.05, 表2)。

图2 中和抗体效价随免疫时间变化趋势

表2 CA16病毒免疫小鼠中和抗体阳转率 %

2.3 不同免疫剂量对中和抗体效价的影响

用原倍病毒液(感染性滴度: 6.62 Lg CCID50/mL)与倍的病毒稀释液(感染性滴度: 5.62 Lg CCID50/mL)免疫小鼠，分析血清中和抗体效价与免疫剂量之间的关系，原倍病毒液免疫的小鼠血清中和抗体效价明显高于病毒稀释液免疫的中和抗体效价(P＜0.05),并且原倍病毒液免疫的小鼠血清中和抗体阳转率也高于倍病毒稀释液的免疫的中和抗体阳转率(表2),差异显著(P＜0.05)，说明剂量的改变与中和抗体效价之间的量效关系。

2.4 小鼠品系及年龄对中和抗体效价的影响

比较两种不同的小鼠ICR与BALB/c的中和抗体效价以及阳转率，BALB/c小鼠明显比ICR小鼠的中和抗体效价高(P＜0.05)，并且阳转率也明显较ICR小鼠的高(P＜0.05, 表2)，可以说明BALB/c小鼠与ICR小鼠相比较, 前者对CA16病毒要为敏感；比较不同年龄小鼠与中和抗体效价的关系，结果表明采用的4周龄、6周龄、8周龄的3个年龄的小鼠对中和抗体效价影响的差异不显著(P＞0.05)。分析比较3个不同年龄小鼠免疫后血清中和抗体阳转率，结果显示差异不显著(P＞0.05)，但是其中4周龄小鼠在初次免疫21 d和28 d的中和抗体阳转率均高于其他两个年龄的小鼠，而在加强免疫后3个年龄的小鼠中和抗体阳转率均达100%。

2.5 小鼠血浆细胞因子检测结果

检测小鼠初次免疫7 d以及加强免疫7 d血浆白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-10、IL-13、γ-干扰素(IFN-γ)以及肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 6个细胞因子的含量，比较小鼠各细胞因子含量的变化，结果加强免疫7 d的小鼠血浆IL-10、TNF-α含量均明显高于初次免疫7 d的血浆中的含量，其中加强免疫7 d血浆的IL-10和TNF-α含量有明显的增高(表3), 而初次免疫7 d血浆的IL-10和TNF-α的含量在检测范围下限无法检出。同时检测初次免疫和加强免疫7 d的阴性血浆的细胞因子含量，其含量在检测范围下限, 这说明初次免疫7d和对照组的血浆IL-10和TNF-γ的含量很低。IL-1β、IL-6、IL-13以及IFN-γ在初次免疫7 d以及加强免疫7 d的含量均处于检测下限，无法检测出含量，说明CA16感染小鼠未能引起IL-1β、IL-6、IL-13以及IFN-γ含量的明显改变。从细胞因子的检测结果可以看出CA16病毒感染小鼠后IL-10和TNF-α的含量均有显著的增加，说明IL-10与TNF-α可以做为CA16感染小鼠后细胞免疫的一个阳性指标。

表3 小鼠血浆细胞因子含量检测结果 pg/mL

3 讨论

HFMD是以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，由多种肠道病毒引起的传染性疾病[6]。EV71和CA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体[7]。EV71疫苗临床研究取得了突破性的进展[8]，这使疫苗的上市得以实现，而疫苗的突破性研究进展在于相关的动物模型的发展与应用，其中包括小动物模型[9, 10]与非人灵长类动物模型[11, 12]。然而与CA16相关的动物模型却少有研究，其中多数为病毒感染机制和毒力评价模型的研究与应用[13]，而用于免疫原性评价的小动物模型未见报道。

本实验采用ICR和BALB/c两种小鼠，选用不同年龄段(4周龄、6周龄、8周龄)，设置不同免疫途径、免疫剂量、免疫时间等多个条件，比较不同实验条件对小鼠血清中和抗体效价以及抗体阳转率的影响，通过检测小鼠血浆中的细胞因子变化，从体液免疫和细胞免疫两个角度对小鼠在CA16活病毒感染后的免疫原性进行评价。

不同免疫途径对小鼠中和抗体效价和抗体阳转率都有明显的影响，其中通过肌肉免疫能有效的激起小鼠体液免疫产生较高的中和抗体，这可能与CA16能在肌肉组织中较好的繁殖有关。两个不同剂量的病毒免疫小鼠，结果显示剂量对小鼠血清中和抗体效价有明显的影响，高剂量的病毒免疫能够更好激起小鼠的体液免疫产生更高的中和抗体效价，而低剂量病毒的免疫原性明显低于高剂量，说明免疫剂量与中和抗体效价之间的量效关系。免疫时间也是影响中和抗体效价的一个明显因素，机体的免疫应答在初次免疫时应答往往较弱，但是当同种抗原再次免疫，其免疫应答明显增加，抗体产生增多并且保留时间也较长，初次免疫21 d与28 d有少量的免疫应答，而在加强免疫后抗体效价明显增高，符合免疫应答机制。实验采用4周龄、6周龄和8周龄的ICR小鼠和BALB/c小鼠， 比较分析不同种属和不同年龄对中和抗体效价和抗体阳转率的影响，显示病毒原液免疫组28 d，BALB/c小鼠抗体阳转率在3个年龄段均达100%，而ICR小鼠抗体阳转率最高的是4周龄达80%。加强免疫后，I C R小鼠各年龄段的抗体阳转率也均达100%，说明加强免疫之前BALB/c小鼠对CA16病毒的感染其免疫应答比ICR小鼠强，在加强免疫后，这种差异就被免疫剂量弥补。但是在病毒稀释液免疫组28 d和加强免疫后7 d, 显示BALB/c小鼠的免疫应答确实高于ICR小鼠。分析小鼠年龄对中和抗体效价和抗体阳转率的影响，表明年龄对中和抗体效价以及抗体阳转率的影响不明显，但4周龄小鼠相比6周龄和8周龄小鼠，中和抗体效价以及阳转率都要高，这样的结果在两个品系小鼠中都成立。之前有报道[14]CA16病毒感染乳鼠，发病乳鼠症状表现为精神萎靡、 活动量减少、 前肢或后肢麻痹， 部分乳鼠前后肢均产生麻痹， 症状加重直至死亡，这说明CA16病毒感染小鼠，随着年龄增长其感染率降低，并且症状也有减轻，这似乎与CA16感染人类的情况类似，主要为婴幼儿易感染，并出现相应的症状，症状加重时会导致死亡，而成人一般为隐性感染。

分析细胞因子含量变化，表明CA16感染小鼠后IL-10和TNF-α的含量明显增高，其结果也许可作为CA16感染小鼠后的阳性指标。

综上所述，ICR小鼠和BALB/c小鼠在感染CA16病毒以后都能明显反映出免疫剂量、免疫时间和免疫途径对中和抗体效价以及抗体阳转率的显著影响，具有一定的年龄差异。此外还能产生明显的细胞免疫应答，可作为CA16活病毒免疫原性评价的动物模型，为进一步系统研究CA16疫苗提供实验资料。

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Immunogenicity of Coxsackievirus Group A Type 16 Strains in Mice

MENG Hua-qing, YANG Ting, XIE Tian-hong, LI Hua, YUE Lei, SONG Xia, ZHANG Ye, XIE Zhong-ping
(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Yunnan Research Center of Vaccine Engineering Technology on Severe Infections Diseases, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research and Development on Severe Infections Disease, Kunming 650118, China)

Objective To evaluate immunogenicity of Coxsackievirus group A type 16 strains (CA16) in mice and provide experimental data for further research.MethodsThe female BALB/c and ICR mice ageing 4, 6, 8 weeks were inoculated subcutaneously, intraperitoneally and intramuscularly with two different doses of CA16 live virus. Blood were respectively taken at 7, 21, 28 and 35 days after inoculation and serum neutralizing antibody titer was analyzed by micro-neutralization test in vitro and six cytokines were determined by ELISA. ResultsSeroconversion rates of the mice inoculated intramuscularly, intraperitoneally and subcutaneously were 83.33%, 40.00% and 0.00% at 28 days after the first inoculation respectively, and antibody geometric mean titers (GMT) were 1∶169, 1∶32 and 0. Seroconversion rates of the mice inoculated intramuscularly, intraperitoneally and subcutaneously were 100% at 7 days after the boost, and GMT were 1∶813 (4.8-fold), 1∶609 (19-fold) and 1∶32; Seroconversion rate was 100%, which was significantly higher than that of 28 and 21 days at the first inoculation. Neutralizing antibody titersand seroconversion rates of the Balb/c were significantly higher than that of ICR, but effect of the age on the neutralizing antibody titers and seroconversion rates was not significant (P＞0.05). The dose has significantly effect on the neutralizing antibody titer and seroconversion rates (P＜0.05). In high dose group, the neutralizing antibody titer and seroconversion rates was significantly higher than low dose. interleukin(IL)-10 and tumor necrosis factor (TNF)-α have a significant increase at 7 days after the boost, compared to the 7 days after the first inoculation.ConclusionBALB/c and ICR mice can be used as animal models of CA16 live virus immunogenicity evaluation, and the most sensitive models was 4-6 week old BALB/c mice.

Coxsackievirus group A type 16 strains (CA16); Immunogenicity; Cytokine;

R373.2+3 Q95-33

A

1674-5817(2016)06-0409-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.06.001

2016-08-23

云南省重点新产品开发计划(2015BC008)

孟华清(1991-), 女, 硕士, 研究方向: 病毒性疫苗研究。E-mail: 754759796@qq.com

谢忠平(1965-), 男, 主任技师。E-mail: xzp218@126.com

Attenuated live vaccine