葛根素对氧诱导大鼠视网膜新生血管模型PECAM-1及VEGF表达的影响

岑璐莎

葛根素对氧诱导大鼠视网膜新生血管模型PECAM-1及VEGF表达的影响

岑璐莎

目的 观察葛根素对氧诱导大鼠玻璃体血管内皮生长因子（VEGF）和视网膜血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）表达的影响，探讨其对新生血管的抑制作用。方法 初生SD大鼠12只，建立氧诱导初生大鼠新生血管模型，随机分成空白组、葛根素小剂量组及葛根素大剂量组，每组4只。通过荧光素眼底血管造影观察各组新生血管渗漏区域改变，免疫荧光染色观察PECAM-1表达，酶联免疫吸附法（ELISA）测定玻璃体VEGF表达量。结果 新生血管渗漏程度、PECAM-1、VEGF表达随葛根素剂量增加而减少；与空白组比较，葛根素小剂量组、大剂量组玻璃体液中VEGF表达均明显降低[（56.58±0.89）pg/mL、（50.72±0.67）pg/mL比（89.11±1.93）pg/mL，P＜0.01]。结论葛根素可通过抑制VEGF及PECAM-1表达，抑制氧诱导大鼠视网膜新生血管增生。

大鼠；视网膜新生血管;葛根素；VEGF；PECAM-1

视网膜新生血管是由眼内疾病引起的，可以导致视网膜水肿、出血、脱离等严重影响视力的并发症，常见于糖尿病视网膜病变[1]。既往相对有效的治疗手段包括眼底光凝及玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，均存在治疗周期长、治疗费用昂贵、治疗效果不确切等缺点[2-3]。葛根素为中药豆科葛属植物野葛中提取的异黄酮类有效成分，具有血管保护和改善循环的作用[4]。我们建立大鼠视网膜新生血管模型，通过眼底血管造影观察视网膜新生血管情况，观察葛根素对氧诱导大鼠玻璃体VEGF及视网膜血小板内皮细胞黏附分子-1（platelet endothelial cell adhesion mole-cule-1，PECAM-1）表达的影响，初步探讨葛根素对视网膜新生血管的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD初生大鼠12只，SPF级，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK（京）2014-0004。

1.2 试剂及仪器 葛根素（四川省玉鑫药业有限公司）、荧光素钠盐（Sigma Aldrich，中国上海）、PECAM-1抗体（Affinity，中国江苏）、ELISA VEGF试剂盒（欣博盛，中国深圳）、海德堡眼底激光造影仪（海德堡，德国）、5415D 型离心机（Eppendorf，德国）、水浴恒温箱（DK-8）、电子显微镜（6V30W）、电热恒温孵育箱（DNP-9082）（上海精宏试验设备有限公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠视网膜新生血管模型的建立[5]SD初生大鼠氧气饲养箱选用30L玻璃干燥器，出口外接三通管。进气管给予特定浓度的氮氧混合气体，控制气流量0.75～0.85L/min，使容器内氧气分压保持稳定。初生当天给予氧含量为50%的氮氧混合气体，第二天换为10%的氮氧混合气，如此交替更换至出生后第14天，母鼠和乳鼠放回常氧环境饲养。造模期间用测氧仪检测容器内氧的浓度，控制室温在23℃±2℃，每天打开一次容器更换垫料，加食，换水，替换正常空气环境下的母鼠。出生后第18天即到正常空气的第5天时，进行鼠尾静脉注射20%荧光素钠0.03mL/kg。使用荧光素眼底血管造影（fluorescein fundus angiography，FFA）经眼底照相观察动物模型眼底视网膜新生血管情况，确认视网膜新生血管形成，确定大鼠视网膜新生血管模型构建成功。

1.3.2 实验分组 模型建立成功后，12只大鼠随机分为空白组、葛根素小剂量组、葛根素大剂量组，各4只，分别予生理盐水5mL/（kg·d）、葛根素250mg/（kg·d）、葛根素500mg/（kg·d）灌胃，1天1次，给药时间为4周。

1.3.3 活体荧光素眼底血管造影（FFA）检测 三组最后一次给药后12h，鼠尾静脉注射20%荧光素钠0.03mL/kg，进行活体FFA的检测，方法同前。

1.3.4 视网膜铺片免疫荧光染色检测PECAM-1 大鼠麻醉后，立即摘除眼球，用4%多聚甲醛溶液固定24～48h，剪开巩膜，去掉眼前节和玻璃体，将眼后段平均分成4份，在水中轻轻漂取视网膜；清水漂洗2～3h，将视网膜放入3%胰蛋白酶消化液中，在37℃恒温箱中孵育2～3h，将视网膜轻轻移入蒸馏水中，轻轻吹打，使残余的视网膜神经成分及内界膜完全脱去，剩下一层透明的视网膜血管膜，再置于0.1%TritonX-100中4℃孵育过夜。移到载玻片上铺平，用PBS冲洗2×5min，加1滴PECAM-1抗体，室温下孵育1h，用PBS冲洗3×5min，滴加一滴TRITC标记的驴抗兔IgG二抗，室温下避光孵育1h，用PBS冲洗3×5min，封片，观察结果。

1.3.5 ELISA检测玻璃体液VEGF含量 取各组大鼠眼球，用纤维眼科剪去除大鼠眼球前节，剪开眼球，分离玻璃体部分，30μL微量注射器吸取玻璃体液，10 000rpm离心30s，采用ELISA试剂盒检测玻璃体液VEGF的含量，具体步骤按说明书进行。

1.3.6 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件对所得数据进行分析，各组大鼠VEGF表达量以（x±s）表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠FFA检测比较 FFA检测结果显示，新生血管渗漏程度随葛根素剂量增加而减少（图1，插页）。以视盘为界将视网膜划分为四个象限，空白组（图1A，插页）：白色渗漏区域颜色浓密，范围累及全视网膜；葛根素小剂量组（图1B，插页）：渗漏区颜色变淡，隐约可见新生血管走行，范围累及约3/4视网膜；葛根素大剂量组（图1C，插页）：上方周边部视网膜见片状新生血管渗漏灶，色淡，范围累及小于1/4视网膜。

2.2 三组大鼠视网膜铺片免疫荧光染色检测PECAM-1比较 免疫荧光结果显示，空白组血小板内皮细胞黏附分子（PECAM-1）表达明显，葛根素大剂量组荧光表达明显降低，但小剂量组荧光强度无明显下降（图2，插页）。

2.3 三组大鼠玻璃体血管VEGF表达比较 模型建立后大鼠玻璃体液中VEGF表达较高，经过葛根素灌胃的大鼠玻璃体液中VEGF表达明显降低，葛根素小剂量组（56.58±0.89）pg/mL、葛根素大剂量组（50.72±0.67）pg/mL，与空白组（89.11±1.93）pg/mL 比较明显减低（P＜0.01）。

3 讨论

葛根素主要成分为异黄酮类化合物，被作为血管保护药物广泛应用于临床，治疗糖尿病视网膜病变疗效显著。葛根素能改善糖尿病视网膜病变的血液流变学和血流动力学状况[6]，既往研究针对葛根素的分子机制较少，且多采用糖尿病大鼠模型进行研究。葛根素能抑制糖尿病大鼠视网膜VEGF的表达[7]，与本研究结果一致，但是葛根素有降血糖的作用[8]，不能排除是葛根素直接抑制VEGF表达，还是通过降低血糖从而抑制VEGF表达。本研究排除血糖因素干扰，采用氧诱导大鼠新生血管模型，该建模方法由Smith等首先提出[5]，具有简便、快捷、结果可靠、重复性强等特点，经过近年来的发展和改进，已成为应用最广泛的视网膜血管新生建模的方法。

视网膜血管新生是一个多因素参与的过程。VEGF是导致视网膜血管新生的主要因素[9]。VEGF由视网膜细胞合成，玻璃体VEGF含量随着视网膜缺血缺氧的程度加重而增加[10]。临床研究也表明，在视网膜新生血管疾病如早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变等中，VEGF均有高表达[11]，且玻璃体VEGF与增生性视网膜病变严重程度有一定相关性[12]。抗VEGF治疗为目前治疗视网膜新生血管的重要手段，主要采用玻璃体腔内注射抗VEGF药物。抗VEGF药物费用昂贵，一支药物自费需要近万元，且抗VEGF的药物半衰期均短，每4～6周需要重复治疗，治疗效果不确切，不能彻底清除新生血管，随着药效消失，新生血管可重新出现[13]。玻璃体腔注射为有创治疗，会导致晶体损伤、视网膜脱离、眼内炎等并发症[13]。本研究表明，葛根素能抑制玻璃体液中VEGF表达，提示葛根素能够通过抑制VEGF，抑制视网膜新生血管增生。

血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1）是免疫球蛋白超家族的成员,在内皮细胞的相互作用和血管发育中起重要作用[14]。在血管生成过程中，PECAM-1高水平表达在血管内皮细胞表面[15]。Dimaio等[16]使用PECAM-1先天缺乏的小鼠建立氧诱导视网膜新生血管模型，视网膜新生血管增生程度显著降低，也间接证实PECAM-1在血管增生中的重要作用。本研究首次发现随着葛根素剂量增大，PECAM-1表达也降低，提示葛根素通过抑制内皮细胞黏附作用来抑制血管新生，与临床研究发现葛根素具有降低血液黏稠度，改善微循环的作用[17]相一致。

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Effect of Puerarin on the Expression of PECAM-1 and VEGF in Hyperoxia-induced Retinopathy of Rats

CEN Lusha

Department of Ophthalmology,Zhejiang Chinese Medical Hospital,Hangzhou(310006),China

ObjectiveTo investigate the effect of puerarin on the expression of vascular endothelial growth fac tor（VEGF） and platelet endothelial cell adhesion molecule 1（PECAM-1） in hyperoxia-inducedretinopathy of rats.MethodsRat models of hyperoxia-induced neovascularization were established（n=12）.Models were divided into blank,small-dose puerarin,and large-dose puerarin groups（n=4,each）.The leakage area was observed using fluorescein fundus angiography,the expression of PECAM-1 and VEGF in vitreum was detected by immunofluorescence staining and ELISA,respectively.ResultsPuerarin administration reduced neovascularization leakage area,inhibited PECAM-1 and VEGF expressions in a dose-dependent manner.Compared with blank,the expression of VEGF in small-dose group and large-dose group were decreased（56.58±0.89pg/mL and 50.72±0.67pg/mL vs 89.11±1.93pg/mL,P＜0.01）.ConclusionPuerarin can inhibit the hyperoxia-induced retinal neovascularization in rats by inhibiting the expression of VEGF and PECAM-1.

rats;retinal neovascularization;puerarin;VEGF;PECAM-1

浙江省中医院眼科（杭州 310006）

（收稿：2017-02-20 修回：2017-05-24）