胆固醇结石症患者与正常人胆汁骨桥蛋白抑成核活性的比较*

郭满，张浩，李伟汉，陈进宏

（1.郑州大学附属南阳医院乳腺甲状腺外科，河南南阳473003；2.复旦大学附属华山医院普外科，上海200040）

胆固醇结石症患者与正常人胆汁骨桥蛋白抑成核活性的比较*

郭满1，张浩1，李伟汉1，陈进宏2

（1.郑州大学附属南阳医院乳腺甲状腺外科，河南南阳473003；2.复旦大学附属华山医院普外科，上海200040）

目的比较胆固醇结石症患者与正常人胆汁骨桥蛋白（OPN）抑成核活性及浓度的差异。方法利用超速离心法结合凝胶电泳从胆固醇结石症患者及正常人胆汁中分离、纯化OPN蛋白。通过HOLAN法测定两组OPN的成核时间及成核活性。通过ELISA法检测胆固醇结石症患者与正常人胆汁中OPN浓度差异。结果胆固醇结石症患者胆汁OPN蛋白较正常人具有较短的成核时间[（17.7±1.07）d vs（20.4±1.90）d]，较弱地抑制胆固醇结晶成核活性；且胆固醇结石症患者胆汁OPN蛋白浓度低于正常人胆汁OPN蛋白浓度[（69.60±5.41）ng/m l vs（82.08±5.63）ng/m l]，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论与正常人比较，胆固醇结石症患者胆汁OPN蛋白抑制胆固醇成核活性较弱、浓度较低。

胆固醇结石；骨桥蛋白；抑成核活性

胆石症是消化系统常见疾病，随着近年来人们生活方式和饮食结构等的改变，目前胆石症发病率呈现出逐渐增高的趋势，其中以胆固醇结石增长最为迅速。胆固醇结石形成的首要条件是胆固醇从胆汁中析出结晶，再此过程中许多对胆固醇成核具有抑制或促进作用的因子发挥重要的调节作用。骨桥蛋白（Osteopontin，OPN）是一种磷酸化糖蛋白，约含314个氨基酸残基，相对分子质量约为44 kD，广泛地分布于多种组织和细胞中，与多种人类疾病相关[1-2]。本课题组前期研究发现，胆汁中OPN作为重要的抑成核因子，具有延长胆固醇结晶、成核的作用[3]。本研究旨在进一步研究胆固醇结石症患者与正常人胆汁OPN蛋白浓度及对胆固醇成核活性影响的差异，以求更进一步探索OPN在胆固醇结石形成过程中所发挥的作用及机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

胆固醇结石症患者的胆汁22份（标本取自郑州大学附属医院南阳医院2014年2月～2014年7月入院接受治疗的胆固醇结石症患者，结石分类参照傅培彬法[4]），正常人的胆汁10份（标本取自该院同期入院接受治疗的腹部外伤和肝移植手术患者），本实验经医院伦理委员会批准并获得患者知情同意。胆汁标本按照STRASBERG[5]所述的方法分装于无菌管中，4℃、10 000 r/min离心15min，去除杂质，然后加入胆汁保存液（0.05%氯霉素、3mmol/L叠氮钠、1mmol/L亮抑酶肽和5mmol/L依地酸钠）置于-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1 胆汁泡的制备取胆固醇结石症患者和正常人胆汁各5 ml，25 000 r/min离心10min（5415D，Eppendorf，德国）。抽取上层清液，并以0.22μm滤膜过滤杂质，滤得清液后加入甲泛葡胺（Sigama）形成密度梯度，然后以45 000 r/min超速离心3 h，针吸法收集上层半透明液即为胆汁泡。

1.2.2 胆汁OPN蛋白的分离和鉴定取100μl胆汁泡，加丙酮200μl充分混匀，2 500 r/min离心15min，针吸法抽弃上清液，留取沉淀物溶解于样品缓冲液中。微量加样器将两组样品分别加于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）梳齿中，50mA恒定电流下电泳。电泳完毕后，凝胶以1%考马斯亮蓝R250染色6 h，之后脱色。切取44 kD相对分子质量标准蛋白及其所对应电泳条带，取其中1份转膜采用鼠抗人OPN抗体（Abcam）用Western blot法鉴定提取蛋白性质。另外部分置入透析袋50mA恒定电流3 h，浓缩，脱盐，冻干备用。

1.3 胆固醇结石症患者与正常人胆汁OPN蛋白抑成核活性比较

参照改良的KIBE法[6]，控制总脂肪浓度（胆盐+卵磷脂+胆固醇）为100 g/L，胆固醇饱和指数为1.2，胆盐/磷脂为4。具体成分：胆盐129.54 mmol/L，卵磷脂32.38mmol/L，胆固醇13.56mmol/L。取胆固醇结石症患者、正常人OPN蛋白及人标准白蛋白，分别加入模拟胆汁中，控制蛋白浓度50μg/ml，每组重复8份，置于37℃恒温保存。连续30 d每日同一时间，在偏光显微镜下观察胆固醇结晶析出情况。参照HOLAN法[7]计算成核时间，即从试验开始到出现镜下可见结晶的时间；一般认为白蛋白无明显成核活性，以胆固醇结石症患者与正常人胆汁OPN蛋白组成核时间/白蛋白组成核时间计算成核活性。

1.4 胆固醇结石症患者与正常人胆汁OPN蛋白浓度比较

建立OPN蛋白ELISA标准曲线，采用倍比稀释法设将包被液纯化的OPN蛋白抗体依次加到酶标板中，每孔100μl，37℃包被2 h，然后用2%牛血清白蛋白37℃封闭2 h后拍净。将系列稀释度OPN蛋白标准品依次加入酶标板孔，每孔100μl，45℃反应1 h后拍净。接着每孔加入HRP 100μl（1∶40稀释），37℃反应1 h后每孔加入新鲜酶标底物液100μl，37℃下置暗处15min，加终止液，取450 nm波长滤光片，于酶标仪上读取每孔OD值，建立OPN蛋白浓度标准曲线，推导曲线方程。然后以ELISA法检测胆固醇结石症患者及正常人胆汁中OPN蛋白浓度。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，成核实验数据采用方差分析，方差分析有意义的基础上，再用LSD检验法进行两两比较；胆汁OPN浓度数据采用独立样本t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胆汁OPN蛋白的分离、纯化结果

SDS-PAGE电泳结果显示，胆固醇结石症患者和正常人胆汁中OPN蛋白的分离、纯化效果良好。见图1。

2.2 胆汁OPN蛋白的鉴定结果

Western blot结果显示，实验中从44 kD相对分子质量所对应电泳条带中提取的蛋白为骨桥蛋白。见图2。

图1 胆固醇结石症患者和正常人胆汁OPN蛋白SDS-PAGE电泳结果

图2 胆固醇结石症患者和正常人胆汁中骨桥蛋白鉴定结果

2.3 胆固醇结石症患者和正常人胆汁OPN蛋白成核活性比较

根据HOLAN法计算人标准白蛋白、胆固醇结石症患者和正常人胆汁OPN蛋白成核时间分别为（15.0±1.64）d、（17.7±1.07）d和（20.4±1.90）d，差异有统计学意义（F=21.431，P=0.007）。胆固醇结石症患者和正常人胆汁OPN蛋白成核时间与人标准白蛋白组比较，经LSD检验，差异有统计学意义（P= 0.023和0.009）；胆固醇结石症患者胆汁OPN蛋白成核时间和正常人胆汁OPN蛋白成核时间比较，经LSD检验，差异有统计学意义（P=0.014）。以胆固醇结石症患者与正常人胆汁OPN蛋白组成核时间/白蛋白组成核时间计算成核活性，胆固醇结石症患者胆汁OPN蛋白成核活性中位数为1.18，低于与正常人1.36。见表1。

2.4 胆固醇结石症患者和正常人胆汁OPN蛋白浓度比较

由ELISA法得到标准蛋白系列稀释吸光度，建立曲线方程为：Y=0.037X（Y：吸光度；X：OPN蛋白浓度mg/ml，相关系数r=0.99）。由ELISA法测得胆固醇结石症患者和正常人胆汁OPN蛋白含量分别为（69.60±5.41）ng/ml和（82.08±5.63）ng/ml，经t检验，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表1 胆固醇结石症患者和正常人胆汁OPN蛋白成核时间和成核活性

表2 胆固醇结石症患者和正常人胆汁OPN蛋白含量测定

3 讨论

OPN作为一种分泌型磷酸化糖蛋白，在人体多种病理生理过程中发挥重要调节作用。早期研究即已发现，OPN在肝脏、胆囊及胆汁中有丰富表达[8]。然而直到近年来OPN参与胆石症形成的一些机制才逐渐为人们所知[9-10]。NAKAI等[11]研究发现，肝内结石患者肝内胆管、腺体及结石中都有OPN的表达。ICHIKAWA等[12]也发现，胆固醇结石症患者胆囊壁富含OPN蛋白及高表达OPN的巨噬细胞浸润，且胆固醇结石核心存在高表达OPN的巢式膜状结构成分。本课题组前期研究观察到OPN能抑制模拟胆汁和人胆汁胆固醇结晶生长，稳定胆固醇/磷脂泡，抑制胆固醇析出[13]。动物实验研究发现，随着胆固醇摄入的增加，豚鼠肝脏和胆囊OPN的表达逐渐增加，6周后降至基线水平，通过对该动态过程的分析，本研究认为胆囊和肝脏通过影响和调节OPN分泌，进而影响胆固醇结石的形成[14]。人体实验研究结果显示，胆囊胆固醇结石症患者胆囊高表达OPN及其受体整合素的纤维化、萎缩的上皮细胞，且胆固醇结石症血清及胆汁OPN浓度较正常人低[15]。因此，本研究认为，OPN在胆囊胆固醇结石形成过程中发挥抑制成核的作用。本实验通过ELISA法进一步证实，胆固醇结石症患者胆汁OPN蛋白含量低于正常人（P<0.05）；同时发现，胆固醇结石症患者胆汁OPN蛋白具有较弱的抑成核作用，其成核时间，抑制胆固醇结晶形成的作用低于正常人胆汁OPN蛋白，两组平均成核时间分别为（17.7±1.07）d vs（20.4±1.90）d，成核活性为（1.18 vs1.36），差异有统计学意义，该结果提示，胆固醇结石症患者胆汁OPN蛋白可能与正常人胆汁OPN蛋白存在结构上的差异，由此导致胆固醇结石症患者胆汁中OPN蛋白抑制胆固醇成核活性较正常人胆汁中OPN蛋白差。

综上所述，胆固醇结石症患者胆汁中OPN浓度的减少及结构功能的差异共同参与胆固醇结石的形成和发展，后续实验有待于进一步研究胆固醇结石症患者与正常人胆汁OPN蛋白结构的差异及其结构差异影响OPN蛋白抑制成核活性的具体机制。

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（张西倩编辑）

Com parison of anti-nucleation activity of biliary osteopontin from cholesterol gallstone patients and normal individuals*

Man Guo1,Hao Zhang1,Wei-han Li1,Jin-hong Chen2
(1.Department of Galactophore and Thyroid Surgery,Nanyang Hospital of Zhengzhou University, Nanyang,Henan 473003,China;2.General Surgery,Huashan Hospital, Fudan University,Shanghai 200040,China)

ObjectiveTo compare cholesterol nucleation inhibiting activity and concentration of biliary osteopontin(OPN)protein from patients with cholesterol gallstone disease and normal individuals.MethodsBiliary OPN protein were separated and purified from cholesterol gallstone patients and normal individuals using ultracentrifugationmethod combined with gel electrophoresis.Nucleation time and nucleation activity of OPN protein from the two groups were determined by HOLAN method.Concentration of biliary OPN protein of cholesterol gallstone patients and normal individualswere detected by Elisamethod.ResultsCompared with normal individuals, the biliary OPN protein of cholesterol gallstone patients had shorter nucleation time(17.7±1.07 vs 20.4±1.90)d,and weaker cholesterol crystal nucleation inhibiting activity.Biliary OPN protein concentration in cholesterol gallstone patients were lower than in normal individuals(69.60±5.41 vs 82.08±5.63)ng/ml,the differences were statistically significant(P＜0.05).ConclusionsComparing with normal individuals,cholesterol gallstone patients have lower biliary OPN concentration and weaker cholesterol nucleation inhibiting activity.

cholesterol gallstone;osteopontin;anti-nucleation activity

R 657.4

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.24.008

1005-8982（2016）24-0039-04

2016-02-26

国家自然科学基金：（No：81270536）

陈进宏，E-mail：jinhongch@hotmail.com；Tel：13801977742