人类肾结石果蝇模型的新进展

戴平 王固新 张东方

人类肾结石果蝇模型的新进展

戴平 王固新 张东方

泌尿系结石是泌尿外科的常见病、多发病，发病率达5%～15%［1］，其中肾结石又占泌尿系结石的40%～50%［2］。泌尿系结石引起的病理损害主要有直接损害、梗阻和感染，三者互为因果，促使病变发展，最终破坏肾组织，损害肾功能，甚至造成肾功能衰竭。因此，尿石症是一种严重危害人类健康的常见病、多发病。近几十年里，由于人类临床研究与动物模型的限制，国内外泌尿系结石的治疗与预防措施的发展受到限制。近几年，简单而典型的果蝇作为一种新兴且强大的人类疾病转化模型出现在不同领域，其中也包括肾结石模型，其可能在泌尿系结石形成的方面能提供至关重要的信息［3］。

1 肾结石模型的建立

随着对泌尿系结石研究的深入，各种利用实验动物的体内和体外尿石模型也逐渐发展，并在这些年有新的突破。结石实验模型不但可以深入了解泌尿系结石的形成过程和机制，且可以筛选抗尿路结石的药物，确认其药理作用和机制。因此，设计和建立尿路结石的动物及体外模型，无疑为探讨尿路结石的发病机制、寻找有效防治尿路结石的药物奠定良好的基础。目前已知的建模方法有通过乙二醇法建立的大鼠等小型哺乳动物结石模型［4］；通过异物植入法建立的猪等大型哺乳动物及目前最新的通过遗传和环境改变诱发的果蝇结石模型。

1.1 大鼠模型 大鼠模型通过乙二醇法建立，乙二醇法是目前较成熟的方法，成石液多为乙二醇与氯化氨。乙二醇为草酸代谢通路的中间产物，亦是草酸的前体，进入体内后转化成羟乙酸，后者既可在羟乙酸氧化酶的作用下直接转化为草酸，也可通过乳酸脱氧酶的催化转化为乙醛酸，乙醛酸又可直接在非酶作用下转化为草酸。因此，摄入乙二醇可导致动物体内草酸增加而形成草酸钙。在有肾结石的人类和大鼠肾乳头表面均能发现草酸钙或磷酸钙的有机晶体。高草酸尿症能引起人类和大鼠的草酸钙结石。饮食因素在肾结石的形成过程中起着重要作用［5-6］。人类和大鼠的草酸代谢几乎是相同的。因此，在诱发人类和大鼠肾结石形成的实验中有较多的相似性。因此大鼠草酸钙肾结石模型可以用于研究人类肾结石形成的机制［7-8］。大鼠模型的优势在于结石形成率高，饲养方便和解剖结构明确。然而，实验性大鼠的繁殖和饲养费用在逐年增加，对大鼠进行遗传操作的成本较高，且伴随着一些技术性的困难。此外，大鼠模型的使用还出现一些其他问题，包括正常动物的异位钙化会存在天然抑制剂及结石形成与溶解的代谢途径调控基因存在未知的启动子［9］。

1.2 猪模型 猪模型通过异物植入法建立，异物植入法是通过微创或开放手术直接将结石或诱发结石的异物放入猪等大型哺乳动物的肾盂或膀胱内。

1.3 果蝇模型 果蝇模型通过改变遗传与环境条件方法建立。果蝇的马氏管（Malpighian tubules）在功能上与人类肾小管相似，马氏管也是溶质转运及排泄钙、磷、尿酸等离子的场所［10］。昆虫学家发现马氏管内的离子沉积凝固物，认为马氏管是果蝇溶质沉积的场所［11］。国外团队应用先进的同步辐射技术发现马氏管内的凝固物与人类肾结石形成时的异味钙化板块具有相同特征［12］。果蝇结石模型提供了一个独特的机会了解泌尿系结石具体发生机制，是可操作性强与可量化的成石方式［3］。

由于泌尿系结石的发病机制至今尚未明确，一直阻碍着对其预防和治疗措施的发展。人体临床研究和泌尿系结石动物模型一直受到成本、道德标准及较长的成石周期的约束。此外，这些哺乳动物模型遗传和生理的复杂性掩盖了实验过程中饮食操作、环境改变、遗传变异对结石形成基本过程的真正影响。

2 果蝇模型的应用

草酸钙模型的建立是研究肾结石的基础。Chen等［9］在果蝇培养基中加入各种浓度的草酸前体物质：乙二醇、草酸钠、羟脯氨酸，经过一段时间后解剖并分离果蝇马氏管可见一水草酸钙与二水草酸钙结晶，分析结石成分主要为草酸钙结石，同时加入枸橼酸钾饲养可发现果蝇结石形成明显减少，寿命明显延长。该实验在一定程度上表明果蝇可能具有与哺乳动物相似的内外源性草酸代谢途径。

果蝇模型在一些肾结石的基础研究中也有新的发展，其中比较突出的是异位钙化，通过研究异位钙化的起始因素，进而对肾结石的发生、发展有重要意义。目前有研究［13］证明抑制人或狗体内黄嘌呤脱氢酶可致肾结石的发生。Chi［3］通过抑制黄嘌呤脱氢酶基因的表达建立果蝇结石模型，并分析结石成分发现果蝇马氏管中出现锌离子高度浓缩现象，这种现象同样也出现在人类肾结石和兰达尔斑块中。为了进一步研究锌离子在异位钙化中的作用，抑制果蝇的锌离子转运体基因表达，从而发现果蝇马氏管中的结石形成受到明显抑制。此外，还通过饮食、药物等多种途径降低锌离子的摄入，并证实锌离子在异位钙化中起十分重要的作用，这些对明确肾结石的发病机制和制定预防措施有重要意义。

众所周知硫酸盐特别是硫代硫酸盐是氰化物中毒的解毒剂也可用于降低铂化物对肾脏的损害。因硫代硫酸根离子与Slc26a6的亲和力比草酸根高，较多实验团队从硫代硫酸盐研究防治草酸钙结石。Landry［14］应用非洲爪蟾蜍卵细胞，通过电生理学实验证明硫代硫酸根离子与Slc26a6的亲和力高于草酸根，并用敲除了草酸转运体基因的果蝇模型，在果蝇培养基中同时加入乙二醇和硫代硫酸钠/硫酸盐，发现果蝇马氏管中的草酸钙结石显著减少，从而证实硫代硫酸根离子通过竞争性结合草酸转运体蛋白拮抗草酸根离子与受体结合，进而减少草酸的分泌和吸收，抑制草酸钙结石的形成。上述研究成功应用果蝇结石模型，为临床应用硫代硫酸盐防治肾结石提供了理论基础和依据。

3 小结

果蝇模型已经成功应用于人类多种疾病及多器官、多系统的研究。但果蝇也有着局限性，其肾脏系统在解剖结构上是分离的且无肾小球样结构，其尿液产生也不是超滤的，而是通过主动分泌水、电解质形成，且对尿液的重吸收功能也不是马氏管而是与其相连的胃肠系统［12，15］。此外，因果蝇体积较小，目前尚无收集并监测果蝇血液、尿液成分的有效方法，这就导致无法确定果蝇是否出现高草酸尿、酸中毒或高草酸血症等，这可能使分析结果出现错误，例如乙二醇处理的果蝇无法确定其寿命缩短的主要原因是酸中毒还是草酸钙，枸橼酸钾处理的果蝇寿命延长的主要原因是枸橼酸钾螯合钙离子还是钾离子浓度升高抑制钙离子分泌从而使草酸钙结石形成减少，亦或是枸橼酸钾中和减轻了由乙二醇引起的酸中毒［12，15］。当然，果蝇的优势也是不容忽视的，这种多用途的动物已经成为一个具有已知实用数据和明确功能优势的人类肾结石翻译模型。低成本获取、简短的生命周期这些优点均有利用快速且低成本建模。果蝇的基因组是高度保守且极具特色，易通过一系列行之有效的和复杂的基因组工作操作。果蝇的突变株系也容易得到及培育。当然，最重要的还是果蝇马氏管的基因活动、解剖结构、生理功能与人类肾小管非常相似。此外，这个模型的直观性及允许简单地定量操作实验条件是其他模型所不及的。总之，人类肾结石果蝇模型既有明显优势又有无法避免的劣势，如何充分利用果蝇模型开展针对肾结石发生、发展过程及其防治的研究工作将是未来重要的课题。

［1］ 周向文,黄冬梅．泌尿系结石的治疗进展．中国误诊学杂志,2010,27(15):129-132．

［2］ 钟文．肾下盏结石的微创外科治疗．国际泌尿系统杂志,2005,25(5):621-624．

［3］ Chi T． A Drosophila model identifies a critical role for zinc in mineralization for kidney stone disease．Plos One,2015．10(5)．

［4］ 杨立军,刘国华,朱江,等,肾结石动物模型的建立．腹腔镜外科杂志,2013(10):785-787．

［5］ Muldowney FP． Prevention of recurrent stones in idiopathic hypercalciuria．New England Journal of Medicine,2002,346(21): 1667-1669．

［6］ Curhan GC,Willett WC,Speizer FE,et al．Comparison of dietary calcium with supplemental calcium and other nutrients as factors affecting the risk for kidney stones in women．Annals of Internal Medicine,1997,126(126):497-504．

［7］ Khan SR．Animal models of kidney stone formation:an analysis．World Journal of Urology,1997,15(4):236-243．

［8］ Evan AP,Bledsoe SB,Smith SB et al． Calcium oxalate crystal localization and osteopontin immunostaining in genetic hypercalciuric stone-forming rats．Kidney International,2004,65(1): 154-161．

［9］ Chen YH,Liu HP,Chen HY,et al．Ethylene glycol induces calcium oxalate crystal deposition in Malpighian tubules:a Drosophila model for nephrolithiasis/urolithiasis．Journal of Urology,2011, 80(187): 1299-1300．

［10］ Dow J, Romero MF．Drosophila provides rapid modeling of renal development,function,and disease．American Journal of Physiology Renal Physiology,2010,299(6):1237-1244．

［11］ Wessing A,Zierold K,Hevert F．Two types of concretions in Drosophila Malpighian tubules as revealed by x-ray microanalysis:a study on urine formation．Journal of Insect Physiology,1992, 38:543-554．

［12］ Miller J,Chi T,Kapahi P,et al．Drosophila Melanogaster as an Emerging Translational Model of Human Nephrolithiasis．Journal of Urology, 2013,190(5):1648-1656．

［13］ Jacinto AM,Mellanby RJ,Chandler M,et al．Urine concentrations of xanthine,hypoxanthine and uric acid in UK Cavalier King Charles spaniels．Journal of Small Animal Practice,2013,54(8):395-398．

［14］ Landry GM．Sulfate and thiosulfate inhibit oxalate transport via a dPrestin(mSlc26a6)-dependent mechanism in an insect model of calcium oxalate nephrolithiasis．Ajp Renal Physiolo gy,2015,310(2):7968-7793．

［15］ Knauf F,Preisig PA．Drosophila:a fruitful model for calcium oxalate nephrolithiasis? Kidney International,2011,80(4):327-329．

518000 广东医科大学附属福田区人民医院