RNA干扰技术在哮喘治疗的研究进展

杨宏宽 潘俊杰 张佳颖 王佳君 王芳 陈芳⋆

·综述·

RNA干扰技术在哮喘治疗的研究进展

杨宏宽 潘俊杰 张佳颖 王佳君 王芳 陈芳⋆

哮喘是一种常见的、慢性的多因素呼吸系统疾病，常以慢性气道炎症为特征。世界卫生组织预计全世界现有3亿哮喘患者，如此高的患病率造成社会经济和卫生保健系统面临严重负担［1］。尽管吸入型糖皮质激素在轻中度哮喘治疗中能有效改善症状及减少急性发作的次数，其在重度及难治性哮喘治疗中的效果难以令人满意。因此，在哮喘治疗中需要寻找新的治疗干预手段。

1 RNA干扰概述

RNA干扰（RNAi）是20世纪90年代在矮牵牛属植物及线虫中发现的由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介导的转录后基因沉默现象。dsRNA进入细胞后，Dicer酶将其特异性识别并裂解成 21 ～23个核苷酸小干扰RNA（samll interfering RNA，siRNA）。双链siRNA与Dicer酶的双链RNA结合形成RNA诱导沉默复合物（RNA induced silencing complex，RISC）。RISC被激活后将siRNA中的双链分开，并催化siRNA的反义链去寻找互补的靶基因 mRNA 链并与之相互结合，随后目的基因mRNA在特异的位点被切割从而导致目的基因降解［2］。目前RNA干扰技术主要包括直接化学合成siRNA及构建短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）的表达载体两种途径。直接化学合成siRNA具有合成方便，但转染效率不确定，且基因沉默持续时间较短。短发夹RNA由两个短反向重复序列及中间一茎环（loop）序列链接组成发夹结构。将siRNA序列设计作为shRNA克隆进载体中，当其转染入细胞内时，该发夹序列被表达出来，形成shRNA，随即被Dicer酶分解茎环产生siRNA，进而由上述RNAi通道产生靶基因的沉默。短发夹RNA表达载体具有基因沉默持续时间长，可构建稳定表达siRNA的细胞株等优点，但费用较高［3］。

2 RNA干扰技术在哮喘治疗中的应用

自RNA干扰技术产生以来，因其对靶基因的良好沉默效果使其迅速成为各个领域的研究热点，其中在哮喘的治疗研究中展现出令人兴奋的进展。目前相关研究主要包括以下五大靶点。

2.1 细胞因子 轻中度过敏性哮喘常以气道慢性炎症的急性加重为特征，表现为2型辅助性CD4+T淋巴细胞（Type 2 T helper cells，Th2）的激活及嗜酸性粒细胞的渗出，并且与IgE的产生，黏液分泌细胞的增生和化生，气管壁的重塑及气道的高反应性相关。Th2细胞分泌的一系列细胞因子如白细胞介素（Interleukin，IL）-5，9，13分别在嗜酸性细胞增多症，肥大细胞增多症，气道黏液过度分泌中起着调控作用。肥大细胞、嗜酸性粒细胞、杆状细胞通过渗出、激活并分泌各自产生的介质，促进气道慢性过敏性炎症的发生［4］。因此较多研究将各种Th2细胞因子为研究靶点，尝试通过RNA干扰技术抑制其表达从而达到治疗哮喘的目标。Lee等［5］通过气道滴入以慢病毒为载体的IL-4特异性shRNA及IL-13特异性shRNA，发现抑制哮喘模型小鼠的气道嗜酸性粒细胞性炎症，减轻气道高反应性及减少IL-4，5，13等Th2细胞因子的释放。Huang等［6］通过气管注射表达IL-5 siRNA的慢病毒后，显著改善哮喘小鼠的气道高反应性和嗜酸粒细胞浸润，从而使哮喘得到控制。Li 等［7］通过对哮喘模型小鼠气道吸入表达IL-23的shRNA，显著减弱IL-23的表达，同时减弱肺部嗜酸性细胞及中性粒细胞的渗出，同时减少血清中IgE，IL-4，IL-17等的表达，起到抗炎作用。

2.2 趋化因子 在哮喘等慢性气道炎症疾病中，招募白细胞进入气道的趋化因子是产生炎症的重要环节。其中，嗜酸性细胞选择性趋化因子如CCL11、CCL24、CCL26等通过结合CCR3受体在招募嗜酸性细胞的聚集与渗出起着重要作用。Errahali 等［8］通过CCL26-siRNA转染至人类II型肺泡上皮细胞，发现显著抑制CCL-5，8，13，15，26等一系列趋化因子的表达，并显著抑制嗜酸性细胞的迁徙与激活，为进一步在人体哮喘治疗提供了新思路。

2.3 酪氨酸激酶 在哮喘的发病机制中，Th2细胞的激活与其分泌的一系列细胞因子起着重要作用。目前已有一系列旨在阻断Th2细胞过度分化，纠正Th1/Th2失衡的研究，其中包括抑制酪氨酸激酶，如淋巴细胞特异性酪氨酸激酶（lymphocyte specific tyrosine kinase，LCK）和脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）。Lck是T细胞分化中起调控作用的酶。抗原递呈细胞（如树突状细胞）将抗原摄取、加工后，由主要组织相容性复合物II（MHC II）携带抗原肽至细胞膜上，并被初始T细胞上的T细胞受体（TCR）识别，后者在Lck的作用下启动一系列信号传导，使Th0细胞向Th2细胞方向分化，并释放一系列Th2细胞因子，导致哮喘的急性变态反应［9］。Zhang 等［10］通过向哮喘模型小鼠尾静脉注射lck特异性siRNA，减少肺组织嗜酸性粒细胞的渗出及减少肺部和血清中IgE，IL-4的表达，从而减轻肺部炎症。Syk是树突状细胞（DC）的抗原递呈过程和FceR介导肥大细胞激活所必需的激酶，在Th2细胞和B细胞活化，以及细胞因子受体所介导的信号传导通路中起重要作用。Huang 等［11］将Syk特异性siRNA经鼻部滴入哮喘模型小鼠中，发现显著减少肺部炎症细胞的浸润。

2.4 表面分子 CD40属于TNF受体超家族的一员，在抗原提呈细胞（APC）的成熟中起重要作用。APC上的CD40与T细胞上的CD154相互作用进而激活T细胞，增加Th2细胞因子的表达及促进T细胞的增殖。Suziki 等［12］构建的以CD40为靶向的siRNA减少哮喘模型小鼠的鼻部症状及嗜酸性粒细胞血症。共刺激分子CD80/ CD86是树突状细胞的表面抗原，通过CD80 /CD86- CD28通路在启动Th活化，促使Th0细胞向Th2细胞方向分化的过程中起重要作用。Li 等［13］通过将CD80和 CD86特异性 siRNA共同转染至哮喘模型小鼠骨髓来源的成熟树突状细胞中，发现降低IL-4等Th2细胞因子及提高INF-γ等Th1细胞因子的表达，抑制Th细胞向Th2细胞的分化，纠正Th1/Th2失衡。Asai-Tajiri 等［14］通过气道滴入CD86特异性siRNA，改善哮喘模型小鼠的嗜酸性粒细胞增多及气道高反应性，降低IL-5，IL-13等Th2细胞因子的释放。

2.5 转录因子 在抑制T细胞向Th2细胞过度分化这一治疗策略的研究中，除上述靶向针对激酶，细胞表面分子等外，靶向抑制转录因子也是一大研究热门。包括信号转导与转录激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）STAT1、STAT5、STAT6、 GATA结合蛋白和NF -κB等。STAT1 是连接多种细胞膜受体与选择性效应器间信号转导的主要蛋白质，在细胞因子调节网络中起着重要作用。刘春凤等［15］通过siRNA沉默STAT1的表达抑制嗜酸性细胞的增殖及减少Th1/Th2细胞比例失衡，减轻气道炎症。JAK-STAT5信号通路是T细胞增殖过程中极为重要的信号传导途径。当STAT5受到TCR相关信号刺激时活化，能引起下游靶基因如cyclin D1、c-myc和bcl-2等抑凋亡基因过表达，从而抑制T细胞凋亡。邱晨等［16］通过构建siRNA抑制哮喘模型小鼠的脾脏T细胞STAT5的表达，抑制T细胞的增殖及促进T细胞的凋亡，从而减轻肺部炎症。GATA3是T细胞中表达多向性的转录因子，其通过正反馈机制维持Th2分化状态，是Th2功能分化及Thl/Th2平衡的关键转录因子。Lee 等［17］通过局部应用以慢病毒为载体的GATA3特异性shRNA，减轻哮喘模型小鼠的气道炎症及气道高反应性。

3 待解决问题

尽管众多应用RNA干扰技术针对哮喘发病机制中不同靶点的实验研究取得富有前景的进展，但要真正将其应用至临床实践中，仍有一些问题亟待解决。

3.1 脱靶效应 脱靶效应指siRNA对非靶mRNA的敲除作用。关于脱靶效应的机制尚不十分明确，目前普遍认为siRNA上的种子区域包括miRNA上的引导链上的第2至第8个核苷酸，能被miRNA所识别，进而siRNA可通过种子区域的杂交启动类似miRNA途径的抑制基因表达的作用。目前一些化学修饰及改变siRNA设计的措施可减少脱靶效应的风险，但会一定程度上降低siRNA的效能，故如何更深入的了解脱靶效应及避免其发生仍需进一步探究［18-19］。

3.2 固有免疫系统的激活 SiRNA中特异的序列如5'-GUCCUUCAA-3'，可被Toll样受体识别进而诱导机体激活固有免疫系统，产生干扰素及促进一系列炎症细胞因子的产生［20］。鉴于哮喘是气道慢性炎症性疾病，siRNA导致的免疫系统的激活有可能加重炎症的进展，诱发哮喘的发作，故需要进一步探讨解决方案。

3.3 给药方式 鉴于全身给药会让siRNA易被血清中的核酸酶降解并经肾脏排泄，同时也会通过TOLL样受体（TLR）激活固有免疫，导致炎症因子的增加，故局部用药在哮喘治疗研究的给药方式中十分重要。目前动物实验的主要给药方式有鼻内滴入或喷洒给药，经气管切开插管给药，经口气道内喷晒给药，以及吸入给药等。鼻内给药因药物难以到达下呼吸道以及肺内的分布不均匀，目前较少应用于哮喘研究。气管切开插管给药虽然效果好，但由于其有创性，可能难以令患者接受。经口气道内喷晒给药在动物实验中多是自制的简易装置，优点是无创、可靠，但应用于人类呼吸道需要开发更舒适、更符合人解剖生理的装置。吸入给药分为计量剂量吸入（MDIs）及干粉吸入（DPIs），是肺内给药的重要方式。但由于目前吸入型的siRNA较少，及需要寻找合适载体在干燥过程中保护核酸免受因侧切力和温度导致的降解，吸入给药仍需改进和研究［21-22］。

3.4 合适载体 SiRNA的负电荷属性及化学易降解性要求在基因干扰治疗中加入载体以增加其稳定性，以及促进其对靶细胞的转染。目前有病毒载体及包括脂质、多聚体等非病毒载体。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、慢病毒等，具有转染成功率高的特点，但其有可能激活免疫系统产生各种并发症，且一些病毒载体会将其基因随机插入宿主的染色体中，以上这些限制病毒载体的应用。与之相比，脂质载体及多聚体载体具有低毒性的特点［23］。寻找安全可靠又富有效率的载体仍是一个挑战。

4 展望

相对于利用小分子，蛋白，单克隆抗体为形式的传统药物，RNA干扰治疗拥有几个优势。与传统药物不同的是，基于RNA干扰的治疗方法几乎可以高选择性、高效抑制各个层次的基因目标的表达，可以根据患者的情况开展个体化的治疗，轻易合成，通过主要部位的鉴别与优化等几个快速的步骤实现引导。如今已有正处于临床试验阶段的治疗哮喘的siRNA药物，如ExcellairTM（ZaBeCor，Bala Cynwyd，PA，USA），一个吸入型靶向抑制Syk激酶的siRNA药物，正处于II期临床试验中，显示出良好的耐受性和一定的疗效［24］。相比于现有的TNF-α抑制剂、白三烯抑制剂等仅作用于一种炎症因子的药物，作用于Syk激酶的siRNA通过作用于炎症发生的初始步骤（B细胞的激活）从而抑制多种炎症因子的释放，因此具有更好的抗炎效果。但哮喘的发病机制涉及诸多通路和分子，仍需进一步研究。RNA干扰技术作为一门新的技术，相信随着化学修饰技术的进步，对脱靶效应研究的深入，及对分子水平及基因水平上的哮喘发病机制的更深入了解，RNA干扰技术可以成为人类控制哮喘新的手段。

［1］ Global Initiative for Asthma． Global Strategy for Asthma Management and Prevention,2016．

［2］ Mehrotra N,Tripathi RM．Short interfering RNA therapeutics: nanocarriers,prospects and limitations．Iet Nanobiotechnology,2015, 9(6):386-395．

［3］ Donald D Rao, John S Vorhies, Neil Senzer, et al． siRNA vs．shRNA: Similarities and differences． Advanced Drug Delivery Reviews, 2009,61(9):746-759．

［4］ Hansbro PM, Kaiko GE, Foster PS． Cytokine/anti-cytokine therapy-novel treatments for asthma．British Journal of Pharmacology, 2011,163(1):81-95．

［5］ Lee CC,Huang HY,Chiang BL．Lentiviral-mediated interleukin-4 and interleukin-13 RNA interference decrease airway inflammation and hyperresponsiveness．Human Gene Therapy, 2011, 22(5):577-586．

［6］ Huang HY,Lee CC,Chiang BL．Short hairpin RNAs against eotaxin or interleukin-5 decrease airway eosinophilia and hyperresponsiveness in a murine model of asthma．Journal of Gene Medicine,2009,11(2):112-118．

［7］ Li Y,Sun M,Cheng H,et al．Silencing IL-23 expression by a small hairpin RNA protects against asthma in mice．Experimental & Molecular Medicine,2011,43(4):197-204．

［8］ Errahali Y J,Taka E,Abonyo BO,et al．CCL26-targeted siRNA treatment of alveolar type II cells decreases expression of CCR3-binding chemokines and reduces eosinophil migration:implications in asthma therapy．Journal of Interferon & Cytokine Research the Official Journal of the International Society for Interferon & Cytokine Research,2009,29(4):227-239．

［9］ Rangarajan S,Mariuzza RA．T cell receptor bias for MHC:coevolution or co-receptors．Cellular & Molecular Life Sciences Cmls,2014,71(16):3059-3068．

［10］ Zhang S,Yang R,Zheng Y．The effect of siRNA-mediated lymphocyte-specific protein tyrosine kinase(Lck)inhibition on pulmonary inflammation in a mouse model of asthma．International Journal of Clinical & Experimental Medicine, 2015,8(9):15146-15154．

［11］ Huang ZY, Kim MK, Kim-Han TH, et al． Effect of locally administered Syk siRNA on allergen-induced arthritis and asthma． Molecular Immunology,2013,53(1-2):52-59．

［12］ Suzuki M,Zheng X,Zhang X,et al．Novel vaccination for allergy through gene silencing of CD40 using small interfering RNA．Journal of Immunology,2008,180(12):8461-8469．

［13］ Li JG,Ym DU,Yan ZD,et al．CD80 and CD86 knockdown in dendritic cells regulates Th1/Th2 cytokine production in asthmatic mice．Experimental & Therapeutic Medicine,2016,11(3)．

［14］ Asai-Tajiri Y,Matsumoto K,Fukuyama S,et al．Small interfering RNA against CD86 during allergen challenge blocks experimental allergic asthma．Respiratory Research,2014,15(1):132-132．

［15］ 刘春凤,任磊,熊瑛．RNAi技术沉默STAT1基因对哮喘小鼠气道炎症的影响．泸州医学院学报,2015(1):7-10．

［16］ 邱晨,张婷,齐晖,等．STAT5基因沉默对支气管哮喘小鼠T细胞增殖的影响．中华结核和呼吸杂志,2012,35(1):50-54．

［17］ Lee CC, Huang HY, Chiang BL． Lentiviral-mediated GATA-3 RNAi decreases allergic airway inflammation and hyperresponsiveness． Molecular Therapy,2008,16(1):60-65．

［18］ Olejniczak M,Polak K,Galka-Marciniak P,et al．Recent advances in understanding of the immunological off-target effects of siRNA．Current Gene Therapy,2011,11(6):532-543．

［19］ Chen X, Liu P, Chou HH． Whole-genome thermodynamic analysis reduces siRNA off-target effects． Plos One, 2012, 8(3): e58326-e58326．

［20］ Naito Y,Ui-Tei K．Designing functional siRNA with reduced off-target effects．Methods Mol Biol,2013,942:57-68．

［21］ Zhou Y,Zhang C,Wei L．Development of RNAi technology for targeted therapy - A track of siRNA based agents to RNAi therapeutics．Journal of Controlled Release,2014,193:270-281．

［22］ Fujita Y,Takeshita F,Kuwano K,et al．RNAi Therapeutic Platforms for Lung Diseases．Pharmaceuticals,2013,6(2):223-250．

［23］ Merkel OM, Rubinstein I, Kissel T． siRNA delivery to the lung: what's new．Advanced Drug Delivery Reviews, 2014,75:112-128．［24］ Xie Y,Merkel OM．Pulmonary Delivery of siRNA via Polymeric Vectors as Therapies of Asthma．Archiv Der Pharmazie,2015, 348(10):681-688．

国家自然科学基金青年项目（81302934）；浙江省科技厅钱江人才计划（2012 R10063）；浙江省博士后科研资助项目（BSH1402070）

310053 浙江中医药大学第一临床医学院（杨宏宽 潘俊杰 张佳颖 王佳君 王芳）

310006 浙江中医药大学附属第一医院（陈芳）

*通信作者