成纤维细胞13因子作用于钠通道1.7选择性调控热痛

·国外医学动态·

成纤维细胞13因子作用于钠通道1.7选择性调控热痛

当前关于伤害性热痛的认识主要局限于温度感受器，如表达在背根神经节（DRG）伤害性感觉神经元上的瞬时受体电位阳离子通道(TRPV1)。但是温度感受器的缺失仅部分地影响热痛，表明热痛的产生和调控还存在未知机制。我们发现在小鼠DRG神经元中条件性敲除胞浆型成纤维细胞13因子(FGF)，导致热痛选择性缺失；敲除了FGF13的DRG神经元，伤害性热刺激不能诱发动作电位的持续发放；FGF13与钠通道(Nav) 1.7作用可以促进热痛的传导，增强伤害性热刺激诱发的Nav1.7电流并维持Nav1.7上膜过程，进而维持动作电位的持续发放。打破FGF13 和Nav1.7相互作用抑制了热刺激诱发的动作电位和痛反射行为。因此，不同于温度感受器，FGF13 和Nav1.7的相互作用对于维持热痛信号的产生和传递是至关重要的。

研究背景

FGF分为外泌型和胞浆型，外泌型FGF在神经发育过程中发挥着重要作用，但对胞浆型FGF功能的研究却很少。FGF13是表达在神经系统中的胞浆型因子，在发育过程中的脑皮质神经元上有瞬时表达；在从发育早期到成年DRG中，FGF13一直高水平表达，其主要有两个剪接体亚型，FGF13A具有核定位信号而入核，而FGF13B只分布在细胞浆中。

伤害性（疼痛）信号的传导需要有相应的膜蛋白参与，如当温度高于42℃时，DRG小神经元上表达的TRPV1就发挥着温度感受器的作用。但是，即便是TRPV1基因敲除鼠，当给予高于52℃的强热刺激时，痛反应也只表现出部分减弱；当刺激温度低于48℃时，痛反应则表现正常。表明还存在其他没有被发现的热痛感受机制。

疼痛信号的传导也需要电压门控钠通道(Nav)的参与，Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9都表达在DRG神经元中，其中河豚毒素敏感型（TTX-S）Nav1.7通道对痛觉的产生和传递尤为重要。临床上发现， 功能增强型Nav1. 7基因突变导致严重的热痛敏，功能丧失型Nav1.7基因突变导致完全感受不到疼痛。全身敲除Nav1.7减弱了完全弗氏佐剂（CFA）诱发的小鼠热痛敏；在DRG神经元中条件性敲除Nav1.7后，急性痛、炎性痛和烧烫伤引起的热痛敏受到了影响。有研究认为胞浆型FGF可以与Nav通道相互作用并调节钠通道的开关及其电流强度，但表达在DRG小神经元上的FGF13在躯体感觉中的功能却不清楚。

在本研究中，我们发现条件性敲除DRG神经元中的FGF13导致热痛的选择性缺失并降低了热刺激诱发的神经元动作电位发放强度；还发现FGF13与Nav1.7相互作用，热刺激增强了二者的相互作用和Nav1.7在膜上的停留时间，并增强了热刺激所诱发的动作电位发放。打破二者的相互作用，会减少热刺激所诱发的动作电位并抑制痛反应。

主要研究结果

1. FGF13表达在机械/热伤害性神经元中

在成年小鼠神经系统中，FGF13在DRG中高表达，主要表达在小神经元上，在肽类和非肽类神经元上都有表达；在脊髓背角的I层和II层、来自DRG的传入神经纤维上也有FGF13表达，同时在坐骨神经上和皮肤无毛区的传出纤维中也发现有FGF13表达。

2. FGF13缺失可以选择性地消除热痛

在Nav1.8基因启动的SNS-cre条件性敲除FGF13（CKO）的小鼠，DRG神经元、脊髓背角中的传入纤维和皮肤传出纤维上表达的FGF13均显著减少；而DRG神经元的总数和形态以及它们向中枢投射的神经纤维、脊髓背角中突触的结构甚或皮肤中的神经纤维都没有明显变化；从DRG到脊髓神经元的突触传递也是正常的。

但是CKO鼠的热痛反射行为消失了，而对于非伤害性温度刺激和伤害性机械刺激的反射却不受影响。CKO鼠在甩尾实验、热辐射实验和热板实验中没有表现出痛反应；在CFA诱发的慢性炎性痛模型中，表现对伤害性热刺激不敏感；但是对CFA模型或SNI（坐骨神经分支选择性损伤）模型诱发的机械痛敏却无影响。对冷痛刺激的反应也正常，温度选择实验发现CKO鼠依然具有能够分辨不同的温度的能力；只是它们对热痛的耐受能力有所增强。福尔马林实验发现CKO鼠也具有双相的痛反应，只是II相峰出现延后而峰高没有变化，表明其化学痛只受到了轻微的影响。此外，CKO鼠的运动功能和自主活动功能都表现正常。Nav1.8和TRPV1蛋白在CKO鼠的DRG中明显升高，表明存在着相关功能基因的代偿现象。电生理记录发现CKO鼠的DRG中对辣椒素敏感的小神经元比例以及辣椒素诱导电流的幅度有所增高。以上结果表明，尽管CKO鼠存在一定的TRPV1代偿性增强，其仍然表现出热痛的选择性缺失。

3. 脑功能磁共振成像（fMRI）显示CKO鼠对热痛诱发的脑活动消失

fMRI研究发现在FGF13未敲除鼠的对侧脑区存在强烈激活信号，如躯体感觉S1和S2区、Retrosplenial granular (RSG)和岛叶皮质、杏仁核(Amygdala)、导水管周围灰质(PAG)，纹状体（尾状核和壳核）、海马的CA1区、丘脑的内侧背核以及束旁核等，而CKO鼠的以上大部分脑区的痛反射消失。

FGF13未敲除鼠显示对侧S1区参与疼痛反射，其他脑区如Amygdala、S2区、纹状体、海马和岛叶等则显示出双侧脑区同等程度激活；而CKO鼠的以上脑区的激活都减弱。FGF13缺失对Amygdala的影响最大，然后依次是纹状体、岛叶、S2区和RSG，对S1区皮层的影响最小。

4. FGF13敲除的DRG神经元对伤害性热刺激产生的动作电位发放减少

电生理记录发现，CKO鼠与FGF13未敲除鼠对伤害性热刺激敏感的DRG神经元数量相近；在未敲除鼠的小神经元，动作电位发放速率在42℃时开始加速，在43℃时达到最大，并保持在该水平至45℃；CKO鼠小神经元的电发放在温度升高时逐渐降低，在45℃时趋于停止。在未敲除鼠神经元中，动作电位遵循“全或无”规则、振幅相对均匀统一；而在CKO鼠神经元中，动作电位振幅随着温度的升高呈现出快速降低。表明虽然CKO的DRG小神经元能够感受到低于42℃的热刺激，但其对伤害性热刺激产生动作电位的能力受损。

对比研究发现，在TRPV1基因敲除鼠尽管一半以上DRG神经元丧失了对热刺激的反应能力，但仍然有相当多数的神经元保持着完整的对热刺激的敏感性，而FGF13敲除鼠对伤害性热刺激依旧敏感的DRG神经元没有减少，只是刺激温度增加到伤害性水平时，其动作电位幅度变小，表明FGF13和TRPV1 通过不同的分子机制参与热痛的调控。

5. 给予外源性FGF13可以逆转CKO鼠的热痛缺失

用表达FGF13B的融合蛋白孵育CKO鼠的DRG神经元，可以逆转其对伤害性热刺激产生的电发放降低，并改善45℃时的动作电位振幅，表明DRG小神经元要保持对伤害性热刺激产生持续电发放的能力，FGF13是必须的。

野生鼠鞘内注射FGF13B-TAT融合蛋白后，发现DRG和脊髓背角中融合蛋白的峰值位于注射后20～60分钟之间。当CKO鼠鞘内注射融合蛋白时，在一段时间内可以逆转CKO鼠的热痛缺失。鞘内注射后在DRG和后爪的足底皮肤中都可以检测到该融合蛋白。以上结果表明，无论是CKO造成DRG小神经元的电发放降低还是在体的热痛缺失都可以通过给予外源性FGF13而逆转。

6. FGF13直接作用于Nav1.7蛋白

FGF13和Nav1.7的相互作用研究发现，FGF13与Nav1.7相互作用强，与Nav1.6相互作用相对弱。与Nav1.7最强的相互作用出现在FGF13B-TAT融合蛋白注射后的20～60分钟内，这与在CKO鼠鞘内给药进而逆转热痛缺失的最佳效应时间相一致；而FGF13几乎不与Nav1.8或Nav1.9发生作用；没有检测到FGF13与TRPV1或TRPV2之间存在明显的相互作用。分子水平研究发现FGF13和Nav1.7羧基端存在直接的相互作用，Nav1.7羧基端的1,876-1,896位氨基酸是FGF13的主要结合位点；对于FGF13，似乎不存在与Nav1.7羧基端相互作用的关键结构域，因为只有全长的FGF13才能结合Nav1.7羧基端。

7. FGF13增加了Nav1.7电流密度

把表达Nav1.7和表达FGF13B的质粒共转染于HEK293细胞，发现FGF13B增加了Nav1.7电流密度，没有形成明显电压依赖性的Nav1.7激活偏移；Nav1.7的电压依赖性失活也没有发生变化。在CKO鼠的DRG小神经元，FGF13缺失可以使TTX-S钠电流减小而不影响电压依赖的Nav通道激活或失活。表明FGF13增加了Nav1.7电流密度，而不影响其激活和失活的电生理特性。

8. 温度刺激强化了FGF13和 Nav1.7的相互作用，并维持了Nav1.7的上膜

将培养的DRG神经元用热水浴处理后立即放冰上冷却，瞬时维持Nav1.7在神经元膜上，发现FGF13未敲除神经元膜上的Nav1.7水平在热处理后没有发生变化，而CKO神经元膜上的Nav1.7水平却是降低的。在没有热刺激的时候，敲除FGF13不影响Nav1.7的上膜；在FGF13缺失的情况下，伤害性热刺激诱发DRG神经元Nav1.7上膜减少，表明维持一定数量的Nav1.7上膜的需要FGF13的存在。

9. 打破FGF13和Nav1.7相互作用可以减轻热痛

可透膜的Nav1.7CT-TAT融合蛋白作为竞争性肽可以竞争性阻断内源性FGF13和Nav1.7的相互作用。在培养的DRG神经元中，Nav1.7CT-TAT能够竞争性阻断DRG神经元中的内源性FGF13和Nav1.7的相互作用。

在甩尾实验中，腹腔注射Nav1.7CT-TAT呈剂量依赖性地延长了甩尾潜伏期，此效应在最后一次注射后的4～6小时达到高峰；注射后，小鼠脊髓背角传入纤维中的内源性FGF13和Nav1.7相互作用明显减少，但DRG中的未见减少，可能是由于DRG表达大量的FGF13和Nav1.7竞争性抑制了Nav1.7CT-TAT的作用。

讨论

1. FGF13/Nav1.7复合物对于维持热痛功能是必要的

本研究表明，CKO鼠选择性丧失了对热痛的反射能力，但保留对其他模式刺激如非伤害性温度刺激和伤害性机械刺激的痛反应功能。FGF13缺陷可以迅速终止DRG小神经元对温度高于43℃的热刺激诱发的电发放，表明热痛的传递是选择性需要FGF13存在的。

TRPV1主要功能在于参与炎症引起的热痛敏和部分高温（＞ 52℃）的热痛敏，即使CKO鼠DRG神经元中TRPV1有代偿性增加，热痛仍然缺失；CKO鼠的DRG热敏神经元数量并没有减少，但是刺激温度达到引起热痛水平时，动作电位不能持续发放，表明FGF13在热痛中的作用与TRPV1不同。温度感受器在启动动作电位后，FGF13/Nav1.7复合体在伤害性温度刺激期间用来维持电发放，即充当保持持续电发放能力的助推器。低剂量的外源性FGF13足以补救CKO鼠DRG神经元的电发放受损和热痛缺失，表明这种机制是非常高效的。

2. 热刺激强化了FGF13和Nav1.7相互作用是Nav1.7参与热痛调控的选择机制之一

Nav1.7对于热痛和机械痛都很重要，Nav1.7的功能获得性突变导致病人严重的热痛敏，而失能性突变又导致完全无痛。Nav1.7缺失会导小鼠致急性痛、炎症或烧伤引起的热痛敏减轻，Nav1.7还参与了小鼠的机械痛。在所有参与痛觉调控的钠通道中，Nav1.7是最重要的。

但小鼠缺乏Nav1.7只表现为部分热痛丧失，与人类的完全不痛表现不同， 这种差异可能是由于小鼠的其他钠通道的适应性代偿而导致的。CKO鼠热痛的缺失比Nav1.7基因敲除鼠以及Nav1.7和Nav1.8双基因敲除鼠的热痛缺失更严重，表明FGF13的功能是不能被代偿的。尽管Nav1.7本身不具有感觉模式的特异性或选择性，但CKO鼠的热痛缺失而机械痛正常，表明热刺激促进的FGF13和Nav1.7相互作用可能是神经感受热痛的选择性机制。

3. 发现了伤害性热刺激特异性激活的脑区

疼痛是一种涉及感觉和情绪变化的复杂体验，在已经被证明了介导伤害性信息的感觉辨别和情感动机方面的区域，例如丘脑的内侧背核和束旁核以及S1区、S2区和岛状皮质等，CKO鼠的fMRI信号减弱；CKO鼠的fMRI信号在Amygdala、海马、尾状核、和RSG等区域降低，直接证明了边缘系统和涉及记忆以及情绪反应的脑区也参与热痛信息的处理过程。对伤害性热刺激反应的弱化在不同的脑区是不同的，表明FGF13缺陷DRG神经元产生的痛觉信号是通过不同的上行传导通路上传到不同的脑区；痛反应信号在调控痛觉下行通路的关键区域PAG也是减弱的。

4. FGF13在病理感觉障碍中的潜在作用

CKO鼠对来自外周组织炎症诱导的热痛敏是缺失的，可能与Nav1.7的在膜上停留时间有关。由于DRG神经元中FGF13和Nav1.7在外周神经损伤后表达降低，所以我们推测FGF13可能主要参与炎性痛、而不参与神经病理性疼痛的调控。根据我们的研究结果，FGF13基因突变的病人可能对热痛刺激不敏感。因此，测试这些病人的躯体感觉功能将帮助我们理解和认识这些疾病及其病理机制，可能让医生尽早应对来保护病人免受潜在危害。

(Yang L,et al. Neuron, 2017, 22: 806 ～ 821. 王 兵 译 刘兴君 校）

编者按：科学家们一直试图发现特异性调控某种痛觉的某一类神经元（包括初级伤害性感觉神经元和脊髓的中间神经元或投射神经元）或某一特定分子，并期望这样的神经元或分子是存在的。但从节省能量的角度来看，多模式（Polymodel）神经元或分子更符合进化论原则。中国科学院神经科学研究所的张旭院士团队近期的研究成果却开启了一个新思路，有这样一类分子如胞浆型FGF13，通过调节多模式分子如Nav1.7，进而调控某一特定的痛觉如热痛。就像细胞内某一信号通路，位于信号中间的分子总是被激活的（如磷酸化），但导致下游的生物学效应在不同的细胞、甚或不同的条件下可能是完全不同，这取决于最上游的信号是来自于哪一种受体或通道分子，取决于它的开关允许什么样的信号进入。是的，确实存在这样的开关分子，那是否还有调节机械痛的开关分子呢？我们拭目以待！

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.04.002