自噬在骨性关节炎中的研究进展*

赵 旭 傅志俭

（山东大学附属省立医院疼痛科，济南250021）

·特约综述·

自噬在骨性关节炎中的研究进展*

赵 旭 傅志俭△

（山东大学附属省立医院疼痛科，济南250021）

骨性关节炎(osteoarthritis, OA)以关节肿胀和疼痛为主要症状，严重影响患者生活质量，寻找治疗骨性关节炎有效药物成为当今研究热点。目前临床主要有：口服非甾体类抗炎药物，关节腔内注射玻璃酸钠等，以缓解疼痛，改善关节活动度的对症治疗，尚未发现有效治愈骨性关节炎的靶向药物。骨性关节炎的病理表现以滑膜炎和软骨退变为主。目前研究发现软骨细胞自噬水平下降是软骨退变原因之一，可能是治疗骨性关节炎药物靶点。该文就自噬定义、相关信号通路及影响因素，自噬在软骨细胞中的作用及骨关节炎中自噬等予以综述，为寻找有效治疗骨性关节炎药物提供新的思路。

骨性关节炎；软骨退变；软骨细胞；自噬

随着全球人口老龄化加重，退行性疾病发病率呈上升趋势，如骨性关节炎(osteoarthritis, OA)。OA以关节肿胀和长期慢性疼痛为主要表现，严重影响病人的日常生活。目前研究表明OA主要发病特点是关节软骨退变和慢性炎症。慢性炎症主要有IL-1、IL-6和TNF-α促进分解的炎症因子共同参与[1]。关节软骨退变是骨关节炎发病机制的中心环节， 主要病理表现是软骨细胞的衰老凋亡[2]，细胞外基质的降解和增生不良引起软骨退化，软骨下的骨硬化导致骨赘形成[3]。因此，维持关节软骨细胞的活性是预防OA关键因素之一。Cheng NT等[4]研究发现， 在OA动物模型中，维持软骨细胞的自噬水平可预防软骨退变，是维持软骨细胞生存的重要方式。

真核细胞通过溶酶体途径对胞质蛋白和细胞器进行降解以维持生存的过程称为细胞自噬(Autophagy)。1956年比利时科学家Christian de Duve在新生小鼠肾组织中观察到细胞中存在大量膜性结构致密体，其于1963年在首次提出这种现象为自噬。自噬可清除细胞受损的细胞器和长效大分子，是维持细胞内稳态不可或缺的机制。已有研究发现OA的发生与软骨细胞自噬水平下降相关[5]。因此，提高软骨细胞自噬水平可能是OA治疗靶点。本文就自噬在骨性关节炎中作用机制予以综述。

1. 自噬相关信号通路

自噬是细胞内细胞器和分子更新的过程，当应激时，如能量缺乏、ROS、低氧环境，保护细胞，避免细胞凋亡，是维持细胞稳态和生存的重要方式。自噬过程是由ATG基因(autophagy associated gene,ATG)介导的自噬性结构形成过程，细胞自噬发生起始时，胞内形成一种称为自噬泡(phagopore)的囊泡样结构，与需降解的胞质成分集结一起。然后自噬泡隔离膜延伸、包裹、封闭胞浆成分，最终形成一个双层膜的结构，即自噬体 (autophosome)，自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体(autopholysome)，将包裹的胞质成分在溶酶体内酶的作用逐步降解，用于细胞重新利用。

ATG基因首次发现于酵母菌中，与之相对应的真核细胞基因也随之确定。目前共发现ATG基因三十余种，其中ATG1、ATG6、ATG8分别对应哺乳动物的ULK-1、Beclin-1和微管相关蛋白1轻链3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)，是自噬的关键基因。ULK-1是自噬泡形成所必需的，ULK-1激酶的失活会抑制LC3Ⅱ形成，抑制自噬发生。其接受自噬中心关键调控因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,mTOR）的调节。能量缺乏时，mTOR受到抑制，mTOR对ULK-1的抑制作用减弱，使得ULK-1活性增强，启动自噬[6]。LC3广泛表达于哺乳动物组织和培养的细胞的可溶性蛋白中，称为胞浆型LC3Ⅰ。当自噬发生时，胞浆形式的LC3Ⅰ通过泛素样酶促反应与磷脂酰乙胺醇结合，转化为磷脂共轭化合物形式的LC3Ⅱ[7]，不断被募集到自噬泡上，对自噬泡的延伸发挥关键作用[8]。自噬泡不断延伸并包裹降解底物，最后形成闭合的自噬小体，它是自噬小体的标志分子，发挥监控自噬作用[9]。通常将LC3Ⅱ和LC3Ⅰ的比值来评估细胞自噬水平。Beclin-1基因又叫BECN1基因，是酵母菌ATG6同源体，Beclin-1表达与自噬水平呈正相关，是自噬的正向调节因子。饥饿等条件下可激活JNK通路，激活Bcl-2磷酸化，从而Beclin-1释放增加，进而激活自噬[10]。P62蛋白参与自噬小体的降解，也是自噬过程中选择性自噬底物，因此在自噬下降时，P62蛋白胞内大量堆积。

启动自噬的中心关键分子mTOR可接受上游多个信号通路变化，调节细胞自噬水平。mTOR存在mTORC1和mTORC2两种形式[11]，其中mTORC2对自噬诱导药物雷帕霉素耐受。mTOR的激活可抑制自噬，使磷酸化的ATG13不能与ATG1（ULK1）结合形成自噬小体，促进核糖体和内质网黏附，从而抑制内质网脱落形成自噬体膜[12]。研究发现mTOR的上调与 OA软骨细胞凋亡、ATG5、Beclin-1和LC3Ⅱ下调相关。而特异性基因敲除mTOR的小鼠，与正常小鼠相比软骨的自噬水平升高，同时软骨细胞凋亡数量减少[13]。

对于mTOR的调控受多种因素的影响，其中Ⅰ型和Ⅲ型磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)均参与自噬调节。生长因子可通过胞外细胞因子受体酪氨酸激酶激活Ⅰ型PI3K，进而激活下游蛋白激酶B (Protein Kinase B, Akt)磷酸化，正向调控mTOR[14]，抑制自噬。但是当营养和能量缺乏应激情况下， PI3K活化的下游的Akt减少，诱导自噬发生[15]。Ⅲ型PI3K可直接与Beclin-1形成复合物，促进自噬。此外，AMP/ATP比值升高激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)，磷酸化AMPK可直接对mTOR产生负性调控，激活自噬[16]。

最近研究发现PI3K/Akt/mTOR和AMPK/mTOR通路对自噬的调节与活性氧(reactive oxygen species,ROS) 有关。Li P等[17]在研究肺炎链球菌感染A549细胞，促进自噬是通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路，并伴随细胞内ROS增加，加入ROS清除剂后，自噬水平下降。可见细胞内ROS水平也是调节自噬关键因素之一。

2. 自噬与骨性关节炎

自噬具有抑制炎症激活作用。Saitoh T等[18]在研究自噬与克罗恩病时发现，ATG16L敲除的克罗恩病小鼠与克罗恩病小鼠相比，外周血IL-1和IL-18明显增加。在无菌环境下，自噬可清除异常的细胞器、蛋白聚集体和胞浆碎片，发挥内源性炎症激活功能，但研究表明正常生理条件下的自噬可以控制炎症的激活，一但自噬被阻断，胞内线粒体去极化积累，导致内源性炎症激活剂释放，激活炎症发生。

相反，炎症也可抑制自噬水平。在OA早期和晚期均有炎症存在，软骨、滑膜和软骨下骨促炎因子表达增加，推进OA关节结构改变和软骨退化[19]。研究发现OA病人外周血单核细胞mTOR表达增加与OA炎症活动期相关，IL-1干预OA软骨细胞mTOR表达增加[13]，提示促炎因子抑制自噬。阮丽萍等[9]在观察骨关节炎大鼠模型时，关节软骨细胞自噬水平降低，Beclin-1和LC3Ⅱ表达下降，但外周血IL-4、IL-10和TNFα显著升高，其两者有相关性。

综上所述，正常生理条件下的软骨细胞自噬活动具有一定抗炎作用，某些促炎因子很可能是软骨细胞自噬水平降低原因之一。

3. 骨性关节炎中软骨细胞的自噬

关节软骨与其他组织器官不同，不存在血管、神经、淋巴组织，其通过来自于滑膜液和软骨下骨扩散至软骨层的氧气和营养[20]，来合成和更新丰富的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)[21]。因此维持软骨细胞健康状态是关节软骨完整性重要因素。

（1）骨性关节炎早期软骨细胞的自噬

在正常成年关节软骨中，自噬维持软骨细胞稳态，关节软骨浅表层的软骨细胞高表达beclin-1、ATG5和 LC3Ⅱ[22]。此外，代谢和饥饿应激初始阶段，软骨细胞的自噬也会增加。因此在关节软骨退变的初始阶段，OA的软骨细胞LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA表达增加[23]。在大鼠颞下颌关节炎模型中，透射电镜观察早期退变的关节软骨细胞，自噬小体增加；伴随mTOR的活性下降[24]，LC3Ⅱ和Beclin-1 的转录和表达均增加。细胞自噬一过性增加是细胞对应激的代偿性反应，利于细胞生存，持续自噬升高，细胞会受到损害而凋亡[25]。Carames B等[26]研究发现在OA病变较轻时，关节软骨中部和深层的自噬相关mRNA和蛋白ULK1、Beclin-1和LC3Ⅱ表达较高，关节软骨表层其表达反而下降[27]，考虑表层软骨细胞受损较深部时间长，增加自噬已失代偿。总之，在应激条件下骨骺生长板中软骨细胞通过调节相关基因提高自噬，从而实现降低细胞代谢，提高能量利用率，使其在恶劣的局部微环境中生存。

（2）骨性关节炎中晚期软骨细胞的自噬

进入中晚期的OA，软骨细胞自噬下降，细胞凋亡增加，软骨退变严重，伴随ECM合成减少。小鼠膝关节炎模型中，ULK1和Beclin-1表达下降与糖胺多糖的丢失相一致，而凋亡相关蛋白PARP p85伴随软骨退化而表达增加[27]，提示自噬水平的降低不能维持细胞生存，进而细胞凋亡增加。研究观察人OA以及小鼠和狗OA模型的软骨细胞，mTOR较正常软骨细胞均过表达，mTOR的过表达与软骨细胞凋亡增加、自噬调节因子ATG3、ATG5、ATG12、ULK1、LC3Ⅱ和Beclin-1的降低密切相关[13]。

（3）年龄相关的软骨细胞自噬

OA的发生风险有许多因素，包括关节损伤、肥胖、遗传学、性别和解剖学因素等，最突出的风险是年龄[28]。2014年的西班牙调查报道，超过300万人诊断为OA，而年龄分布多在60～64岁[29]。软骨细胞自噬水平也与年龄相关。Carames B等[27]还观察了GFP-LC3转基因的C57BL/6J小鼠，将绿色荧光蛋白GFP融合在LC3上，观察到老年小鼠与年轻小鼠相比，关节软骨自噬小体数量和自噬区域显著减少，提示自噬的基础水平也与年龄相关，随着年龄增加自噬水平降低，从而原发性OA多发于中老年，软骨细胞自噬水平下降是重要因素之一[30]。

4. 展望

随着对骨性关节炎软骨细胞自噬下降研究逐渐明了，探索治疗OA精确有效的方法成为重任。目前非甾体类抗炎药、氨基葡萄糖是OA常用口服药物，关节腔内臭氧注射治疗在临床已广泛开展，临床研究表明30～40 µg/ml医用臭氧注射可显著缓解骨关节炎的疼痛[31]，在动物骨关节炎模型中，40 µg/ml医用臭氧关节腔注射促进关节软骨基质胶原网修复[32]，而医用臭氧是否对软骨细胞自噬产生影响，仍不清楚。最近提出的雷帕霉素，是一种mTOR抑制剂，直接作用于软骨细胞的mTOR，提高细胞自噬，是潜在治疗骨关节炎的靶向药物，也为我们探索治疗OA提供新的方向。

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10.3969/j.issn.1006-9852.2017.04.001

国家自然科学基金（81271346）

△通讯作者 zhijian_fu@163.com