白骨壤果实抗菌活性部位筛选及低极性成分GC-MS分析*

孙雪萍，徐 艳，刘布鸣

(1.广西壮族自治区中医药研究院，广西中药质量标准研究重点实验室，广西南宁 530022；2.广西壮族自治区海洋研究所海洋生物技术重点实验室，广西北海 536000)

白骨壤果实抗菌活性部位筛选及低极性成分GC-MS分析*

孙雪萍1，徐 艳2，刘布鸣1

(1.广西壮族自治区中医药研究院，广西中药质量标准研究重点实验室，广西南宁 530022；2.广西壮族自治区海洋研究所海洋生物技术重点实验室，广西北海 536000)

【目的】研究白骨壤Avicennia mavina (Forsk.) Vierh.果实的抗菌活性部位及其有效成分。【方法】以6株致病菌为抗菌活性部位筛选模型，采用有机溶剂萃取法将白骨壤果实的乙醇提取物分为石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相等不同极性部位，通过测定抑菌圈直径(Diameter of inhitition zone，DIZ)和最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration，MBC)进行抗菌活性研究，并采用GC-MS技术对经过甲酯化后的石油醚相进行化学成分分析。【结果】白骨壤果实乙醇提取物的石油醚相对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和藤黄八叠球菌3株指示菌株表现出一定的抑菌活性；从白骨壤果实石油醚相中鉴定出19个化合物，主要为脂肪类，均为首次从白骨壤果实中鉴定出。【结论】白骨壤果实石油醚相具有良好的抗菌活性，其中的脂肪酸类是主要抗菌活性物质。

白骨壤果实 抗菌活性 石油醚相 GC-MS

0 引言

【研究意义】红树植物白骨壤 Avicennia mavina (Forsk.) Vierh.，又名海榄雌[1]，为马鞭草科 Verbenaceae白骨壤属 Avicennia。该属植物我国只有一种，主要分布于福建、广东、广西、海南4省及台湾、香港、澳门地区沿海有红树林生长的滩涂。白骨壤果实俗称“榄钱”、“海豆”，味甘、微苦、性凉，具有清热、利尿、凉血败火的功效，是降压通血管的民间食疗植物[2]。白骨壤果实全国年产量在30万t以上，是一种尚未规模开发利用的食用、保健和药用新资源[3]，具有较高的学术研究价值和开发利用价值。【前人研究进展】白骨壤果实含有丰富的营养成分[4]，并含有酚苷类[5-6]和生物碱类等[7]化合物。7种溶剂的白骨壤果实提取液显示出一定的自由基清除能力[3]。黄丽莎等[1]对白骨壤果实精油化学成分进行了GC-MS分析。高秀梅等[8]研究发现白骨壤果实的水提物属实际无毒级物质。熊拯等[9]发现白骨壤种子总黄酮对大豆油有一定的抗氧化效果，且具有量效关系。【本研究切入点】目前国内外主要是对红树植物枝叶部分化学成分进行研究[2,10-14]，对白骨壤果实缺乏系统充分的药效物质基础研究。【拟解决的关键问题】对白骨壤果实的乙醇提物以及不同极性部位进行抗菌活性检测，研究白骨壤果实对6株致病菌的抑制活性，并应用GC-MS技术对活性部位石油醚相浸膏进行甲酯化后的化学成分分析，为进一步研究白骨壤果实药效物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

白骨壤果实样品于2014年8月采自广西北海，由海南东寨港国家级红树林自然保护区管理局钟荣才副教授鉴定。

5株人体致病菌(指示菌株)：大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、和藤黄八叠球菌(Micrococcus luteus)；1株海洋致病菌：副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。菌株均为海南师范大学化学化工学院郑彩娟副教授赠送。

LB液体培养基和LB平板：根据文献[15]进行制备。

药品与仪器：甲醇、乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、二甲基亚砜(DMSO)、氢氧化钾、无水硫酸钠等均为国产分析纯；Thermo Trace GC ultra DSQ Ⅱ色质联用仪(Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 供试样品的制备

鲜白骨壤果实(1.5 kg)，经95%乙醇(V/V)超声波提取5次，每次30 min，浓缩提取液得浸膏69.0 g，浸膏用水混悬后，分别用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩后得到石油醚相(28.0 g)，乙酸乙酯相(13.0 g)，正丁醇相(17.0 g)，剩余水相蒸干得浸膏(5.5 g)。

1.2.2 初筛

初筛采用纸片扩散法(Disk-diffusion method)[16-17]测试抑菌圈直径(Diameter of inhitition zone，DIZ，mm)。

1.2.3 最小杀菌浓度的测定

采用试管稀释法(Tube dilution method)[18-19]测定初筛有活性的样品的最小杀菌浓度(Minimum bactericidal concentration，MBC，mg/mL)。

1.2.4 甲酯化处理

取石油醚相浸膏1 g，置于50 mL具塞烧瓶中，加石油醚20 mL使其溶解，加0.4 mol/L KOH-CH3OH溶液10 mL摇匀，置于40℃恒温水浴1 h，加入20 mL蒸馏水摇匀，静置待分层清晰后取上层清液，经无水硫酸钠脱水，过滤，滤液作为供试品溶液。

1.2.5 GC-MS分析

Thermo Trace GC ultra DSQ Ⅱ色质联用仪，色谱柱：VF-5MS(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；进样量1.0 μL，溶剂延迟2.00 min；分流比为50∶1；载气为高纯He，流速为1.0 mL/min；石油醚相的升温程序：50℃保持2 min，以5℃/min 升至130℃，保持5 min，再以5℃/min升至300℃，保持10 min。电离源EI；电子能量70 eV；操作系统：Xcalibur；谱库NIST02。

2 结果与分析

2.1 5种提取物的抑菌活性

白骨壤果实5种提取物对指示菌株的抑菌作用表现不同(表1和表2)。白骨壤果实乙酸乙酯相对6株指示菌株表现出较好的抑菌活性；石油醚相对金黄色葡萄球菌、蜡状芽孢杆菌和藤黄八叠球菌3株指示菌株表现出一定的抑菌活性；正丁醇相对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌3株指示菌株抑菌活性较弱；乙醇提取物对4株指示菌株表现出一定的抑菌活性；水相对指示菌株没有明显的抑菌活性。由此可见，白骨壤果实乙酸乙酯相的抑菌效果最好，其次是石油醚相。

表1 不同提取物的抗菌活性

Table 1 The antimicrobial activity of different extracts against various bacteria

样品Sample指示菌株抑菌圈直径DIZofindicatorstrain(mm)金黄色葡萄球菌S.aureus副溶血弧菌V.parahaemolyticus大肠杆菌E.coli蜡状芽孢杆菌B.cereus枯草芽孢杆菌B.subtilis藤黄八叠球菌M.luteus乙醇提取物Ethanolicextract7―77―6.5石油醚相Petroleumetherfraction8――8―7乙酸乙酯相Ethylacetatefraction888878正丁醇相nButanolfraction778―――水相Aqueousphase――――――

注：抑菌圈直径以平均值表示，“―”表示无活性

Note:DIZ expresses in average，“-”means no activity

表2 白骨壤果实乙醇提取物及各相的最小杀菌浓度

Table 2 The MBC of different extracts against various bacteria

样品Sample指示菌株最小杀菌浓度(MBC,mg/mL)金黄色葡萄球菌S.aureus副溶血弧菌V.parahaemolyticus大肠杆菌E.coli蜡状芽孢杆菌B.cereus枯草芽孢杆菌B.subtilis藤黄八叠球菌M.luteus乙醇提取物Ethanolicextract>100/>100100/100石油醚相Petroleumetherfraction50//50/50乙酸乙酯相Ethylacetatefraction255050505025正丁醇相nButanolfraction>100>100100///

注：“>100”表示最小杀菌浓度大于100 mg/mL，“/ ”表示未测

Note:“>100” means MBC>100 mg/mL，“/”means not detect

2.2 石油醚相甲酯化后的GC-MS分析

在本实验中，利用GC-MS技术探讨石油醚相中抗菌活性物质的组成。对经甲酯化处理后的石油醚相进行GC-MS分析，得到白骨壤果实石油醚相总离子流谱(图1)，对各峰通过 Xcalibur工作站NIST标准质谱图库进行检索，用峰面积归一化法计算出各组分的相对百分含量，共鉴定出19个化合物，占石油醚相总峰面积的77.22%(表3)。石油醚相中主要为低级性化合物，其中脂肪酸类化合物占总比重的74.06%，主要成分有油酸甲酯(30.30%)、饱和的及不饱和的棕榈酸甲酯(共26.60%)、硬脂酸甲酯(9.30%)、十一酸甲酯(3.75%)和癸酸甲酯(3.06%)等。

图1 白骨壤果实石油醚相气质分析总离子流图

Fig.1 GC-MS total ion current figure of petroleum ether extract from the fruits of Avicennia mavina

表3 白骨壤果实石油醚相中低极性化合物GC-MS分析

Table 3 GC-MS analysis of low-polar compounds in the petroleum ether fraction from the fruits ofA.mavina

序号No.保留时间(RT,min)化合物Compound相对质量分数Relativecontent(%)118.44异十六烷2,2,4,4,6,8,8heptamethylnonane0.18220.492苯基丙烯酸甲酯Methyl2phenylprop2enoate0.13322.671,1,1三氟5甲基2,4二庚酮1,1,1trifluoro5methyl2,4henanedione0.17423.68癸酸甲酯Decanoicacidmethylester3.06524.28壬二酸二甲酯Nonanedioicaciddimethylester0.13628.27十一烷酸甲酯Undecanoicacidmethylester3.75729.561乙酰基2,7萘二酚1acetyl2,7naphthalenediol0.24831.6914甲基十五烷酸甲酯14methylpentadecanoicacidmethylester0.13932.01(Z)十六烯酸甲酯Methylpalmitoleate1.301032.66棕榈酸甲酯Methylhexadecanoate23.001133.9311棕榈烯酸甲酯15methyl11hexadecenoicacidmethylester1.301235.032甲基4三甲基硅基1丁烯3炔2methyl4trimethylsilyl1buten3yne0.321335.96反油酸甲酯Methyltrans9octadecenoate30.301436.35硬脂酸甲酯Methylstearate9.301537.30棕榈酸丁酯Butylhexadecanoate1.201638.08癸酸甲酯Methylncaprate1.501740.67硬脂酸丁酯Butylstearate0.281841.71三甲基苯氧基硅Trimethyl(phenoxy)silane0.821947.3410甲基月桂酸甲酯10methyldodecanoicacidmethylester0.11

3 结论

抗菌实验结果显示，白骨壤果实石油醚相对其中3株菌都有一定的抑制活性，最小杀菌浓度为50 mg/mL。乙酸乙酯相浸膏抗菌活性也较好，有进一步对其做活性物质基础研究的必要性。油醚相甲酯化处理后进行GC-MS分析，共鉴定出19个化合物，为首次从白骨壤果实中鉴定出，其中油酸和棕榈酸占50%以上。石油醚相中鉴定出的油酸可以调节血脂、预防肿瘤、改善记忆等，棕榈酸可以抑制胰岛葡萄糖转运蛋白2、胰岛素、胰腺十二指肠同源异型盒因子1和rRNA的表达，显著改善对胰岛的脂毒性作用[20]。研究白骨壤果实的营养价值和药理活性，对开发相关产品的高值化利用，提升红树林的经济价值具有重大的现实意义。

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(责任编辑：陆 雁)

Antibacterial Activities Evaluation and GC-MS Analysis of the Low Polar Components from the Fruits ofAvicenniamavina(Forsk.) Vierh.

SUN Xueping1,XU Yan2,LIU Buming1

(1.Guangxi Key Laboratory of Tradtitonal Chinese Medicine Quality Standards，Guangxi Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences，Nanning,Guangxi，530022，China；2.Guangxi Key Laboratory of Marine Biotechnology，Guangxi Institute of Oceanology，Beihai，Guangxi，536000，China)

【Objective】The antibacterial fractions and constituents of the fruits of Avicennia mavina were screened.【Methods】The antibacterial activities of the ethanolic extract and organic fractions of the fruits of Avicennia mavina from the South China Sea were evaluated by diameter of inhitition zone (DIZ) and the minimum bactericidal concentration (MBC).And the low-polar compounds in the petroleum ether fraction were also analysed by GC-MS after methyl esterification.【Results】The petroleum ether fraction showed antibacterial activity on Staphylococcus aureus,Bacillus cereus and Micrococcus luteus.And 19 compounds were firstly identified from the fruits of Avicennia mavina by GC-MS,most of which were lipids.【Conclusion】It was proposed that lipids should be the main antibacterial substances in the petroleum ether fraction of the fruits of Avicennia mavina.

fruits of Avicennia mavina,antibacterial activity,petroleum ether fraction,GC-MS

http://www.cnki.net/kcms/detail/45.1075.N.20161122.1645.002.html

2016-04-18

孙雪萍(1982-)，女，博士，助理研究员，主要从事药用生物资源研究。

*广西中药质量标准研究重点实验室自主研究课题(桂中重系201509)和广西自然科学基金资助项目(2016GXNSFBA380011)资助。

Q949.761.7，R282.77

A

1002-7378(2016)04-0245-05

网络优先数字出版时间:2016-11-22 【DOI】10.13657/j.cnki.gxkxyxb.20161122.001