秋水仙素处理甘草种子染色体加倍研究

杨振华

（杨凌职业技术学院生物工程分院，陕西杨凌712100）

秋水仙素处理甘草种子染色体加倍研究

杨振华

（杨凌职业技术学院生物工程分院，陕西杨凌712100）

在低温下，用0.05%，0.20%，0.40%秋水仙素水溶液分别处理甘草的萌动种子1，2，3 d，干种子4，6，8 d，比较不同质量分数处理和不同处理时间对种子的萌发率、加倍率及嵌合率的影响。结果表明，用0.40%秋水仙素处理萌动种子3 d染色体加倍效果最好，加倍率可达66.67%；萌发率随处理时间的延长有降低的趋势；嵌合率因秋水仙素质量分数和时间的不同而各异，最高可达34.62%。

甘草；秋水仙素；萌动种子；干种子；染色体加倍

甘草属于豆科（Leguminosae）甘草属（Glycyrrihizal）灌木状多年生草本植物，因具有极强的药用价值而被广泛应用于临床医学中。此外，因特殊的生理性能，甘草可在寒冷、干旱环境中生长，在植被破坏严重已开始沙化的地区还有防风固沙的巨大生态效益[1-2]。

甘草通过多倍体育种有2个明显效果：一是可增加药材产量，如国外用秋水仙素点滴曼陀罗的腑芽，育成四倍体植株，其植株形态大小及质量都超过了二倍体曼陀罗。二是可提高药材化学成分。曼陀罗四倍体叶中的生物碱含量大致是二倍体的2倍。薄荷的挥发油含量、茼蒿的山道年含量、除虫菊精的含量多倍体也都比二倍体高[3]。

本试验对多倍体育种中的化学诱导多倍体进行研究，采用秋水仙素对甘草种子进行处理，通过比较秋水仙素不同质量分数处理和不同处理时间对种子萌发率、加倍率及嵌合率的影响，观察染色体变异情况。

1 材料和方法

1.1 供试材料

选择甘肃产地的胀果甘草为试验材料，其染色体数目为2n＝2x＝14[4]。

1.2 试验方法

试验设在杨凌职业技术学院生物遗传实验室。

1.2.1 浸种法处理干种子试验选取300粒大小一致的甘草种子平均分配于10个培养皿中，其中，1个培养皿以蒸馏水处理作对照，另外9个培养皿分为3组加入不同质量分数（0.05%，0.20%，0.40%）秋水仙素，给予不同时间（4，6，8 d）低温冷藏，测定萌发率。之后再用自来水冲洗干净后置于常温下，待胚根长至0.5～1.0cm时，切取根尖进行倍性检查[5-7]。

1.2.2 浸种法处理萌动种子试验选取300粒大小一致的甘草种子平均分配于10个培养皿中，其中一个培养皿以蒸馏水处理作为对照，另外9个培养皿分为3组加入不同质量分数（0.05%，0.20%，0.40%）的秋水仙素处理刚露白的萌动种子，给予不同时间（1，2，3 d）低温冷藏后测定萌发率，萌发率＝萌发种子/待测种子×100%。之后再用自来水冲洗干净后置于常温下，待胚根长至0.5～1.0 cm时，切取根尖进行倍性检查。

1.3 染色体数目鉴定的方法

待胚根长至0.5～1.0cm时，于10：00—10：30切取根尖，放入装有2 mg/L8-羟基喹啉的小瓶中预处理2 h左右。经蒸馏水冲洗再用卡诺固定液固定根尖4 h。倒去固定液，用蒸馏水浸洗根尖3～5次，每次5～10min。然后在装有根尖的小瓶中加入1mol/L HCl数滴后，放入（60±0.5）℃的水浴锅中酸解8～9 min。最后再用蒸馏水冲洗根尖并吸取根尖的水分，用改良苯酚品红进行染色，压片镜检。记录每个根尖10个细胞染色体数目，以计算加倍率和嵌合率。加倍率＝加倍种子数/处理种子数×100%；嵌合率＝嵌合体数/处理种子数×100%。

2 结果与分析

2.1 秋水仙素对甘草种子萌发率的影响

由图1可知，萌动种子在秋水仙素处理下的萌发率均达到75%以上，尤其是0.20%秋水仙素处理2 d的萌发率最高，达到93%以上。

从图2可以看出，所有处理干种子的萌发率均偏低，其萌发率在60.0%～76.67%，其中，以0.05%秋水仙素处理干种子6 d的萌发率最高，达到76.67%。秋水仙素处理萌动种子的萌发率明显高于干种子。

2.2 秋水仙素对甘草染色体加倍率的影响

由图3可知，随着秋水仙素质量分数的增加，处理1，3 d的萌动种子加倍率明显增加；0.20%，0.40%秋水仙素处理萌动种子3 d的加倍率较高，分别为52.17%，66.67%。

由图4可知，处理4 d的干种子染色体加倍率随着秋水仙素质量分数的升高而升高，从15%增加到63.64%；处理6 d秋水仙素质量分数为0.20%的加倍率仅为25%，质量分数0.40%时其加倍率最高，为33.33%；处理8 d的染色体加倍率在秋水仙素3个质量分数下呈现低—高—低的趋势，并以0.20%质量分数时的加倍率最高（45%）[8]。说明在不同秋水仙素质量分数水平下，当质量分数较低时，随着处理时间的延长，加倍率明显增加，而在较高质量分数下，随着处理时间的延长，加倍率却明显下降。

2.3 秋水仙素诱导染色体加倍中的嵌合体表现

虽然秋水仙素处理甘草种子能够导致细胞倍性的增加，但同时也会使细胞产生倍性嵌合现象。由图5可知，当处理时间为1，2 d时，随着秋水仙素质量分数秋水仙素的升高，嵌合率呈渐增趋势；而第3 d时，随着秋水仙素质量分数的升高，嵌合率反而降低，其中，以0.05%秋水仙素处理萌动种子3 d的嵌合率最高，达到34.62%。

由图6可知，嵌合率以秋水仙素处理干种子6 d较高，而0.20%秋水仙素处理4 d最高，达27.78%。说明秋水仙素的质量分数不同对嵌合率有较大影响，但嵌合率与秋水仙素质量分数不成简单的线性关系，嵌合率的增加还与其他影响因子如处理时间、温度等相关，它们之间的影响规律有待进一步研究。

3 结论与讨论

秋水仙素本身是有毒物质[9]，在处理种子时会对种子的萌发产生毒害作用，从而影响种子的萌发率。本研究结果表明，随着秋水仙素处理时间的延长，种子萌发率有下降的趋势，尤其是干种子的萌发率。秋水仙素处理时，药剂质量分数的大小与处理时间的长短直接影响处理效果[10-11]。一般情况，质量分数高时处理时间短，反之处理时间长。处理方法的不同也会影响处理效果。浸种法处理时，一般会对根系产生毒害作用[9]。本试验采用浸种法，当秋水仙素处理干种子4 d时，随着秋水仙素质量分数的增加，萌发率下降。用秋水仙素处理时，要选择最佳时间对材料进行固定、解离、染色和压片[12-15]。而何时固定材料是影响试验成败的一个主要因素。本试验中，取胚根时间为10：00—10：30，这段时间正是甘草种子细胞分裂最旺盛时期。秋水仙素处理种子时，选取材料的染色体数目多少也是试验成败的一个因素[7]。本试验中，选取的材料是胀果甘草种子（2n＝2x＝14），染色体数目不多，易观察其有无加倍。秋水仙素诱变育种时还存在嵌合体问题。植物的茎尖分生组织由2种或2种以上遗传型不同的细胞组成，并由这些细胞共同发育成完整的植株，称为嵌合体[16-19]。有研究通过顶芽切割和丛生芽技术，诱导再生苗来分离秋水仙素诱导罗汉果四倍体中形成的嵌合体。在本试验中，嵌合率随着秋水仙素处理质量分数和时间的不同而各异，有研究表明，嵌合率的变化受处理温度、处理时间、秋水仙素质量分数互作的影响[20-22]，其规律有待进一步研究。

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Study on Doubling Chomosomes of Licorice Seeds Treated by Colchicine

YANGZhen-hua
（Department ofBiological Engineering，YanglingVocational and Technical College，Yangling712100，China）

The dry seeds and germinating seeds of the licorice were treated with 0.05%,0.20%,0.40%colchicines under low temperature for 4,6,8 d and 1,2,3 d,respectively.To study the influence of different concentration and time of colchicines to the germinatingrates,the chromosome-doubled rates and the embedded rates.The results showed that the highest chromosome-doubled rate was got after germinating seeds were treated with 0.40%colchicines for 3 d,it was up to 66.67%.With time prolonging,the germinating rates had the trend to decline;the embedded rates were different at different concentration of colchicines and treatment time,the highest rate was up to34.62%.

licorice;colchicin;the germinatingseeds;the dryseeds;doublingchromosome

R282

A

1002-2481（2016）03-0294-03

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.05

2015-10-28

杨凌职业技术学院校内研究基金项目（201400020）

杨振华（1981-），男，甘肃白银人，讲师，硕士，主要从事生物技术应用教学及研究工作。