基因型对茄子小孢子培养诱导单倍体的影响

王利英，乔军，石瑶，连勇，刘富中，陈钰辉，张映，李素文

（1.天津科润蔬菜研究所，天津300384；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

基因型对茄子小孢子培养诱导单倍体的影响

王利英1，乔军1，石瑶1，连勇2，刘富中2，陈钰辉2，张映2，李素文1

（1.天津科润蔬菜研究所，天津300384；2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京100081）

茄子游离小孢子培养是获得单倍体的最有效途径，可以快速固定优良性状，缩短育种年限。试验选取茄子五大类型共计46份材料进行小孢子培养。结果表明，愈伤组织诱导率与4℃低温预处理天数间没有相关性，只与基因型有关。继续进行分化培养，白肉紫红圆茄愈伤组织较易诱导产生单倍体，诱导率高达69%；其次是绿茄和绿肉紫黑圆茄，诱导率达到56%；紫萼长茄诱导率为7%，绿萼长茄最难诱导。通过进一步完善茄子单倍体诱导体系，单倍体诱导率平均提高到39%，可直接辅助单倍体育种。

茄子；小孢子培养；单倍体；基因型

茄子单倍体研究较早，20世纪80年代，顾淑荣[1]从茄子花粉粒离体培养经愈伤组织获得少量再生植株。Tuberosa等[2]培养茄子花药成功通过胚状体途径成苗，并观察了单倍体植株的形态特征。Miyoshi[3]用直接游离小孢子培养的方法经愈伤组织途径得到再生植株。连勇等[4]应用小孢子培养的方法获得茄子大量体细胞融合杂种株的小孢子再生植株。孙振英等[5]利用茄子离体小孢子培养技术，通过愈伤组织再生获得了茄子二倍体栽培种的再生植株。由于茄子基因型差异和培养基敏感性，迄今最高单倍体诱导率为7%左右，离育种实践要求差距较大。

基因型是影响茄子单倍体诱导的一个关键性因素[6-7]，基因型材料的不同决定了愈伤组织诱导率也不同[8-9]。Chambonnet等[10-12]研究发现，相同诱导条件下，不同基因型材料的愈伤组织诱导率及分化率存在差异。Rao[13]研究发现，不同茄子基因型单倍体诱导所需萘乙酸（NAA）浓度不同。Afele等[14]用同样方法游离茄子品种“Wase Shinkuro”产生胚状愈伤组织，而品种“Kumamoto Naga”却没分化产生胚，认为可能是由不同品种mRNA表达上的差异所致。

本研究选取茄子五大类型共计46份试验材料进行小孢子培养，设置4℃低温进行花药预培养，选用液体KM培养基进行游离培养诱导愈伤组织，直到分化再生单倍体幼苗，辅助单倍体育种。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验于2014年秋季在天津科润蔬菜研究所试验基地进行，共种植46份试验材料。茄子类型和品种名称如表1所示。6月15日播种育苗，7月25日定植于日光温室，每份材料种植20株，株行距为60 cm×70 cm，平畦地膜覆盖，常规栽培管理。

表1 茄子小孢子培养所用46份试验材料

1.2 试验方法

1.2.1 花蕾采集及保存9月1日开始采集门茄花蕾，采集标准为花冠与萼裂处平齐或略高（2 mm以内），花冠包裹紧密，11月底前采集结束。采集时间为晴天9：00—10：00。按品种不同分别用牛皮纸袋包好后进行花药预培养剩下的花蕾置于4℃冰箱保存，第2天进行花药预培养，第4天结束。

1.2.2 花药预培养提前配制花药预培养基：MS＋0.2 mg/L 2，4-D＋1 mg/L KT＋3%蔗糖＋7 g/L琼脂＋0.5 g/L活性炭。预培养基pH值5.8，高温121℃、高压0.1 MPa灭菌20 min。超净工作台提前通风30 min以上，75%酒精擦拭工作台面，培养基灭菌后及时在超净工作台上分装至直径60 mm培养皿中备用，每皿装10 mL培养基。

将不同品种花蕾依次放入三角瓶中标记好名称，每瓶滴2滴吐温20，自来水冲洗5 min清洁花蕾表面。在超净工作台上用75%酒精浸泡30s后，用6.5%次氯酸钠溶液（有效氯大于10%）浸泡20 min，再用无菌水清洗5 min，清洗3次。灭菌后的花蕾用无菌纸吸干表面水分备用。

在超净工作台上用镊子剥开花冠，取出花药接种在培养基表面，每皿接种2个花蕾的花药，每个品种接种3皿，记录品种名和接种时间，封口膜封口后转移至36℃培养箱中暗培养6 d。

1.2.3 小孢子培养提前配制小孢子液体培养基：KM＋0.2 mg/L 2，4-D＋1.0 mg/L KT＋1 mg/L 6-BA＋5%葡萄糖，pH值5.8。用0.22 μm孔径针头式过滤器过滤灭菌，4℃冰箱保存。

挑取预培养结束未染菌的膨大花药接种于液体培养基中，用无菌刀从花药中部切成两段，用镊子挤压游离小孢子后将花药挑出，再用封口膜封口。

1.2.4 分化提前配制分化培养基：MS＋0.01 mg/L NAA＋2.0 mg/L 6-BA＋2%蔗糖＋5 g/L琼脂＋0.5g/L活性炭。分化培养基pH值5.8，高温121℃、高压0.1 MPa灭菌20 min。

当液体培养基中花药顶端和中部出现愈伤组织时，长到2 mm以上即可转接至分化培养基，置于光照强度1 500～2 000 lx、光照14 h/d，温度25℃的组培架上培养。每间隔15 d切割继代一次，30 d后可长出绿色芽苗。

1.2.5 再生提前配制生根培养基为：1/2 MS＋0.2 mg/L IBA＋5 g/L琼脂＋3%蔗糖＋0.5 g/L活性炭。生根培养基pH值5.8，高温121℃、高压0.1 MPa灭菌20 min。

当绿色芽苗长至1～3 cm高时即可转接至生根培养基，置于光照强度2 000 lx、光照14 h/d、温度25℃的组培架上培养。10 d左右切口处可见不定根生长，20 d后长成带根小苗。

2 结果与分析

2.1 小孢子诱导愈伤组织及成苗比例

本试验共分五大类供试基因型，分别是绿茄、绿肉紫黑圆茄、白肉紫红圆茄、紫萼长茄和绿萼长茄，基本覆盖所有茄子栽培类型。从表2可以看出，供试基因型有66%可以诱导出有效愈伤组织，41%可以诱导出芽，出芽后成苗率可达100%。

表2 茄子小孢子培养愈伤组织诱导及成苗比例

2.2 4℃冷藏天数对小孢子培养出愈率的影响

表3 4℃冷藏花蕾天数对绿茄花药有效出愈率的影响%

表4 4℃冷藏花蕾天数对绿肉紫黑圆茄花药有效出愈率的影响%

表5 4℃冷藏花蕾天数对白肉紫红圆茄花药有效出愈率的影响%

表6 4℃冷藏花蕾天数对紫萼长茄花药有效出愈率的影响%

由表3～6可知，4℃冷藏花蕾天数对花药有效出愈率没有显著影响，绿茄、绿肉紫黑圆茄和紫萼长茄出愈率保持在20%以上，白肉紫红圆茄出愈率达到69%，而绿萼长茄出愈困难，出愈率为0。

2.3 愈伤组织诱导出芽率统计

愈伤组织出芽与否与基因型有关，茄子愈伤组织诱导出芽比较困难。由表7可知，紫萼长茄出芽率最低，只有7%，白肉紫红圆茄出芽率达到69%，绿茄和绿肉紫黑圆茄出芽率均为56%。茄子再生相对愈伤组织诱导和不定芽分化比较容易，再生率可达100%。

表7 愈伤组织出芽率统计%

3 讨论

小孢子培养技术在白菜、菜花、萝卜等蔬菜作物育种中广泛应用，明显缩短了育种年限[15-17]。与十字花科蔬菜相比，茄果类蔬菜小孢子培养难度大，大多试验停留在愈伤组织或类胚状体阶段，成功应用的报道较少[18-20]。本试验在前人研究的基础上进行了大量优化调整，旨在克服基因型影响，并进一步提高有效出愈率和成苗率，最终达到应用水平。通过小孢子培养开展相关品种DH系的构建工作，一方面可以加快品种纯化速度，获得优异纯合自交系，另一方面为茄子相关性状科学研究提供精确永久的调查群体，对于分子遗传图谱构建和QTL定位有重要作用，可直接辅助单倍体育种。

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Effects of Genotype on Induction of Haploid Induced by Microspore Culture of Eggplant

WANGLi-ying1，QIAOJun1，SHI Yao1，LIANYong2，LIUFu-zhong2，CHENYu-hui2，ZHANGYing2，LI Su-wen1
（1.Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，Tianjin 300384，China；2.Institute ofVegetables and Flowers，Chinese AcademyofAgricultural Sciences，Beijing100081，China）

Isolated microspore culture of eggplant was the most effective way to obtain haploid,which could quickly fix good traits and shorten the breedingperiod.In this paper,five types ofeggplant including46 genotypes were selected for the microspore culture.The results showed that induction rate ofcallus was related to the genotype rather than the days ofpretreatment oflowtemperature at 4℃.In differentiation culture,white flesh purple round eggplant was easy to be induced to produce haploid,induction rate was up to 69%,followed by green eggplant and green flesh purple round eggplant up to 56%,purple calyx long eggplant up to 7%,and green calyx long eggplant was the most difficult one.Haploid induction rate of eggplant increased from 7%to 39%by further improvetion of the haploid induction system,and could directlyaid haploid breeding.

eggplant;microspore culture;haploid;genotype

S641.1

A

1002-2481（2016）03-0284-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.03.02

2015-11-02

国家科技支撑计划项目（2014BAD01B08）；天津市农业科技成果转化与推广资助项目（201304020）；天津市财政局农业财政资金项目

王利英（1971-），女，天津蓟县人，研究员，硕士，主要从事茄子育种研究工作。李素文为通信作者。