高效液相色谱法测定甲癣涂剂中水杨酸的含量

刘园，张华峰，宋青，戴博

(空军总医院，北京 100142)



◇药物分析◇

高效液相色谱法测定甲癣涂剂中水杨酸的含量

刘园，张华峰，宋青，戴博

(空军总医院，北京 100142)

目的 建立甲癣涂剂中水杨酸的含量测定方法。方法 色谱柱：Venusil XBP(L)C18柱(4.6 mm×100 mm,5 μm)为固定相，甲醇∶水(H3PO4调pH=3.0)=45∶55为流动相，检测波长303 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温:20 ℃。进样量 20 μL。结果 水杨酸回归方程为：A=5.14×104C-1.06×104(r=0.999 9)；线性范围为：4.98～159.36 mg·L-1。平均回收率分别为98.0%、100.8%、100.5%。结论 该方法操作方便，结果准确可靠，可用于甲癣涂剂中水杨酸的含量测定。

高效液相色谱法；甲癣涂剂；水杨酸

甲癣涂剂[1-2]是由水杨酸、碘化钾、冰醋酸等成分制成的涂剂，为真菌抑制剂，可治疗手、足癣。水杨酸为甲癣涂剂的有效成分之一，起到溶解角质，防腐杀菌的作用，为了更好的控制该制剂的质量，提高本制剂的质量标准，本研究参考中国药典2010版二部，采用十八烷基硅胶键合色谱柱，建立了灵敏、专属、可靠地高效液相色谱(HPLC)法测定甲癣涂剂中水杨酸的含量，经试验验证，该方法保留时间适宜，可以准确的测定样品中水杨酸的含量，获得了满意的结果。

1 仪器与试药

1.1 仪器 高效液相色谱仪(岛津LC-10AT液相色谱系统：岛津LC-10AT.vp泵，SPD-10A检测器，CTO-10A中央控制器，岛津Class-vp工作站)；电子分析天平(Sartorius，型号：BS 110S)；紫外可见分光光度计(岛津，型号：UV-2401PC)。精密pH计(上海雷磁仪器厂，型号：PHS-3B)。

1.2 试药 水杨酸对照品(中国食品药品检定研究所，批号100106-201104)；其余原料均由空军总医院提供。甲醇为色谱纯；硫代硫酸钠和磷酸为分析纯；水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。甲癣涂剂样品(空军总医院提供，批号：20130801、20130802、20130803)。

2 方法与结果

2.1 检测波长的选择 由本品在流动相中的紫外吸收图谱可知，水杨酸在303 nm波长处有最大吸收，因此本研究选择303 nm波长作为水杨酸的测定波长，结果见图1。

图1 水杨酸对照品在流动相中紫外吸收图谱

2.2 色谱条件 色谱柱：Venusil XBP(L)C18柱(4.6 mm×100 mm,5 μm，天津艾杰尔公司)；流动相：甲醇∶水(H3PO4调pH=3.0)=45∶55；检测波长303 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温为20 ℃。进样体积 20 μL。

2.3 溶液的制备 对照品溶液的制备：精密称取水杨酸对照品约10.00 mg于20 mL量瓶中，甲醇溶解并定容，得对照品储备液。精密吸取1 mL储备液于10 mL量瓶中，甲醇稀释并定容，即得对照品溶液。

硫代硫酸钠溶液的制备：精密称取约2.50 g硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)于100 mL量瓶中，用新沸的冷水溶解并定容，摇匀，即得0.1 mol·L-1的硫代硫酸钠溶液。

供试品溶液的制备：精密吸取本品2 mL，于100 mL量瓶中，精密加入硫代硫酸钠溶液10 mL，用水稀释并定容，摇匀，精密吸取上述稀释溶液2 mL于100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

2.4 方法的专属性 分别取对照品溶液和供试品溶液20 μL，按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。水杨酸的出峰时间为3.0 min，出峰前后没有杂质干扰，分离度大于1.5，理论塔板数按水杨酸峰计算不低于3 000。结果表明，该色谱系统的适应性良好。结果见图2，3。

图2 对照品溶液的HPLC图谱

图3 供试品溶液的HPLC图谱

2.5 线性范围的考察 精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL对照品储备液分别置10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀。分别取各溶液20 μL注入色谱仪，记录色谱图和峰面积，由峰面积(A)对溶液浓度(C)作线性回归，得回归方程：A=5.14×104C-1.06×104，r=0.999 9。结果表明在4.98～159.36 mg·L-1浓度范围内，本法的线性良好。

2.6 稳定性试验 分别取水杨酸溶液于日内(0、2、4、6、8、12 h)测定，结果峰面积分别为2572349、2568574、2567219、2571243、2565748、2562854，RSD为0.14%。结果表明，水杨酸溶液室温放置12 h内稳定，故在此时间内对测定结果无影响。

2.7 耐用性试验 实验方法的正常检测条件：Venusil XBP(L)C18柱(4.6 mm×100 mm,5 μm)；流动相：甲醇∶水(H3PO4调pH=3.0)=45∶55；检测波长303 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温为20 ℃。

取本品，照2.3项下制备对照品溶液和供试品溶液，分别考察流动相中有机相比例变化±2%，pH值变化±0.1，柱温变化±2℃，检测波长变化±5 nm，流速变化±0.1 mL·min-1时，水杨酸含量的变化，并与正常检测条件结果进行比较，计算各条件下3次测定结果的RSD均小于5%，结果表明：在不同的变化条件下，水杨酸的含量没有变化，表明水杨酸检测法耐用性很好，检测条件的变化对测定结果几乎无影响。

2.8 重现性试验 取本品，由不同操作人照2.3项下制备对照品溶液和供试品溶液，按相同的色谱条件测定。计算不同操作人测定的水杨酸的含量变化，3个不同操作人测得的水杨酸平均含量RSD小于2%，表明本法重现性良好。

2.9 回收率试验 按照处方配制空白甲癣涂剂，精密加入一定量的水杨酸，得低、中、高不同浓度的溶液(相当于样品浓度的80%、100%、120%)，照2.3项下供试品溶液的制备方法制备，取制备好的样品溶液20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，取峰面积带入线性方程计算回收率，每个浓度平行测定3次。回收率均符合要求，结果见表1。

表1 水杨酸回收率试验结果

2.10 样品的测定 精密吸取样品2 mL，于100 mL量瓶中，精密加入硫代硫酸钠溶液10 mL，重蒸水稀释并定容，摇匀，精密吸取上述稀释溶液2 mL于100 mL量瓶中，重蒸水稀释至刻度，摇匀，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图；另取水杨酸对照品溶液适量，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中水杨酸的含量。结果20130801、20130802、20130803三批样品水杨酸的含量分别为50.4、50.7、49.8 g·L-1。

3 讨论

对于水杨酸的含量测定方法，文献已报道有分光光度法[3]、离子色谱法[4]、化学发光法[5]以及HPLC法[6]等。结合水杨酸的结构特点，且在紫外区有吸收，本研究参考中国药典2010版二部，采用十八烷基硅胶键合色谱柱[7]，建立了灵敏、专属、可靠地HPLC法测定甲癣涂剂中水杨酸的含量，经试验验证，该方法可以准确的测定样品中水杨酸的含量。

甲癣涂剂的主要成分包括水杨酸、冰醋酸、碘、碘化钾，其中碘在紫外吸收区也有吸收，干扰水杨酸的测定，如采用液液萃取法萃取水杨酸，试验操作繁琐、回收率低；为减少操作步骤和测定误差，采用过量的硫代硫酸钠将单质碘还原为碘离子[8]，稀释后直接注入HPLC分析。操作简单，测量精准，可获得满意研究结果。

本实验分别对紫外分光光度法和HPLC法进行了比较，HPLC法测定水杨酸出峰时间为3.0 min，出峰前后没有杂质干扰，分离度大于1.5，专属性更强；且紫外分光光度法易受到环境、人为操作等因素的影响，所以HPLC法是稳定性和准确度更高的方法。

[1] 中国人民解放军总后勤部卫生部.中国人民解放军医疗机构制剂规范[M].北京：人民军医出版社，2003：143-144.

[2] 王爱平，高露娟，席丽艳.足癣患者治疗现状调查[J].中国真菌学杂志，2014,9(6)：335-338.

[3] 郑维国，栗家言，胡红.紫外分光光度法测定甲癣涂剂中水杨酸含量[J].药物鉴定，2009,18(11):24-25.

[4] 段沅杏，李干鹏，张承明.水杨酸测定方法现状分析[J].云南化工，2010,37(6):45-47.

[5] 谢成根，李淮芬.流动注射化学发光法测定黑白癣药水中的水杨酸[J].中国卫生检验杂志，2004,14(4):422-423.

[6] 黄洁，李锋武，刘鹏鸣,等.反相高效液相色潽法测定复方水杨酸酊中水杨酸和苯甲酸含量[J].中国药业，2012,21(20):39-40.

[7] 国家药典委员会.中国药典(二部)[S].北京：中国医药科技出版社，2010：附录29.

[8] 李媛媛.用硫代硫酸钠清除碘痕迹[J].中国误诊学杂志，2011,11(21):5137.

Determination of salicylic acid in paint for onychomycosis by HPLC

LIU Yuan，ZHANG Huafeng，SONG Qing，et al

(TheGeneralHospitalofAirForce,Beijing100142,China)

Objective To establish a method for determination of salicylic acid in paint for onychomycosis by HPLC.Methods The chromatographic analysis was carried out on a Venusil XBP-C18(L)column(4.6 mm×100 mm,5 μm)with methanol and water solution(the pH value was adjusted to 3.0 by phosphoric acid)as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1.The column temperature was 20℃ and sample size was 20 μL.The detection wavelength was 303 nm.Results Linear regression equation of salicylic acid wasA=5.14×104C-1.06×104(r=0.999 9),and it was obtained in the range of 4.98～159.36 mg·L-1.The average recoveries were 98.0%,100.8%,and 100.5%.Conclusions The HPLC method shows a good separation,reproducibility and accuracy,which can be used to determine salicylic acid.

HPLC;Paint for onychomycosis;Salicylic acid

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.11.009

2016-08-04，

2016-09-23)