甘肃地区孕妇孕中期干血斑产前筛查结果分析

刘芙蓉，郝胜菊，王 兴，郑 雷，闫有圣

(甘肃省妇幼保健院医学遗传学中心，兰州 730050)



·论 著·

甘肃地区孕妇孕中期干血斑产前筛查结果分析

刘芙蓉，郝胜菊△，王 兴，郑 雷，闫有圣

(甘肃省妇幼保健院医学遗传学中心，兰州 730050)

目的 通过检测孕妇的干血斑甲胎蛋白(AFP DBS)、干血斑游离绒毛膜促性腺激素-β亚基(free-βhCG DBS)浓度，对孕中期胎儿患唐氏综合征(DS)、18-三体综合征(ES)和神经管畸形(ODNT)的风险进行评估。方法 运用时间分辨荧光法定量测定孕妇干血斑中AFP DBS、Free-βhCG DBS浓度，采用Life cycle 3.2软件计算风险。结果 5 001例孕妇中高龄65例，占总筛查人数的1.3%，其中DS、ES和ONTD的阳性筛查率分别为3.7%(185/5 001)、0.4%(20/5 001)和4.3%(215/5 001)。确诊阳性病例8例，其中高龄5例。结论 孕妇孕中期干血斑DS产前筛查对实现质控统一管理，提高筛查覆盖度，降低出生缺陷有重要意义。

孕中期； 唐氏综合征； 干血斑产前筛查

唐氏综合征(DS)产前筛查是采用简单、方便、易行、无创的检测方法，在广大孕妇人群中筛查出怀有某些先天缺陷的高危胎儿的高危个体。DS是先天缺陷的主要疾病之一，目前尚无有效治疗手段，唯一可行的干预措施是通过产前筛查和产前诊断尽早发现，及时终止妊娠，有效预防和减少DS患儿出生，降低出生缺陷，提高人口素质。目前，我国DS产前筛查的主要模式为孕中期孕妇血清二联或三联筛查，但覆盖率不高，偏远贫困地区仍无法开展DS筛查。据统计，我国发达地区筛查率可达50%，筛查覆盖率全国平均仅为13%，明显落后发达国家[1-2]。同时，血样转运困难，筛查中心分散，质控管理难度大、成本高。DS干血斑产前筛查技术由于其具有标本采集简单、转运成本低廉、标本稳定性增强、实验统一性提高、便于质控管理等优势，适合偏远不发达地区提高产筛覆盖率。本研究通过对2015年1～6月甘肃地区孕妇孕中期干血斑产前筛查的结果进行分析，阐明其在产前筛查中的优势及局限。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1～6月甘肃省妇幼保健院产前诊断中心进行孕中期干血斑产前筛查的孕妇5 001例。孕妇知情同意并填写产前筛查申请单，孕周15～20周+6，其中65例年龄大于35岁，平均年龄28.65岁。月经规律者根据末次月经推算孕周，月经不规律者以B超测得胎儿双顶径(BPD)推算孕周。

1.2 标本采集 制作滤纸干血片标本，参照2010年《新生儿筛查技术规范》要求制作保存血膜，滤纸采用贵州里定生物科技有限公司生产的血标本采集卡，血斑制作采用可控式点血器法(DIFF-SAFE)[3]，制备直径大于10 mm的滤纸血斑3个，于室温下干燥后，密封于4 ℃冰箱中保存待检。

1.3 试剂与方法 仪器采用芬兰Wallac公司生产的DELFLA-1235型全自动时间分辨免疫荧光分析仪进行测定。检测试剂盒运用苏州新波生物技术有限公司生产的干血斑甲胎蛋白与游离人绒毛膜促性腺激素-β亚基(AFP/Freeβ-HCG DBS)双标试剂盒。

1.4 检测方法 用直径为3.2 mm的打孔器在血斑半径1/2 处打下待检血斑1个于反应微孔中，其中将标准品和质控品各2个(复孔)于相应反应微孔中，上机选择相应AFP/Free-hCGbβDBS程序进行检测。

1.5 风险评估 采用PE公司提供的Life cycle3.2软件结合孕妇年龄、体质量、孕周、是否吸烟及相关病史等因素，将血斑测定值换算成中位数倍数值(MOM值)，计算胎儿患DS、18-三体综合征(ES)及神经管畸形(ONTD)的风险率。DS风险截断值为1/270；ES风险截断值为1/350,ONTD风险截断值为MOM≥2.5。对筛查出的高危妊娠孕妇，在本人知情同意的情况下，建议接受羊膜腔穿刺，进行羊水细胞培养及染色体核型分析，对筛查对象追踪随访至胎儿出生。

2 结 果

2.1 筛查结果 本中心共接收5 001例进行DS孕中期产前筛查的干血斑，其中筛出DS高风险185例，ES高风险20例,ONTD高风险215例。其中年龄大于35岁的孕妇共65例，占筛查人群的1.3%。DS的初筛阳性率为3.7%(185/5 001)，ES的初筛阳性率为0.4%(20/5 001)，ONTD的初筛阳性率为4.3%(215/5 001)，总阳性筛查率为8.4%(470/5 001)。见表1。

表1 各年龄组DS阳性筛查率

2.2 各孕周不同标记物的中位数浓度及MOM值 本研究中所有待检孕妇的孕周均介于15～20周+6，干血斑甲胎蛋白(AFP DBS)与干血斑游离绒毛膜促性腺激素-β亚基(free-βhCG DBS)两种标记物在各孕周均有差异，其中AFP DBS随孕周的增加而逐渐增高，妊娠15周的中位数浓度为24.16 mU/L，妊娠20周升高至43.25 mU/L；free-βhCG DBS随孕周的增加中位数浓度逐渐降低，妊娠15周的中位数浓度为36.53 ng/mL，妊娠20周下降至15.75 ng/mL。见表2。

表2 各孕周不同标记物的中位数浓度及MOM值

2.3 阳性确诊病例结果分析 初筛阳性患者在本院产前诊断中心接受羊膜腔穿刺，进行羊水细胞培养及染色体核型分析，妊娠结局是确诊阳性患者8例，其中高龄5例，确诊21-三体胎儿5例，18-三体胎儿1例，超雌胎儿1例，克氏综合征1例。筛查低风险孕妇中至今无DS、ES及ONTD患儿出生。其染色体核型分析结果见表3。

表3 染色体异常儿的筛查结果

续表3 染色体异常儿的筛查结果

注：-表示无数据。

3 讨 论

3.1 实施产前筛查在我国普及难度大,而以滤纸干血斑作为母血载体进行DS产前筛查经济简便[4],成为目前的研究热点之一。干血斑DS产前筛查结果显示，生育患儿风险随年龄增长而增长。Wald等[5]报道，仅通过年龄对DS产前筛查检出率可达30%。据文献统计，所有出生的DS患儿中35岁以前妇女娩出的占30%,35岁以后的妇女娩出70%[6]。Merkatz等[7]将血清甲胎蛋白(AFP)应用于DS产前筛查,结合年龄因素可将检出率提高20%。将不同标志物的拟然比相乘，再乘以孕妇年龄特异性风险得到孕妇DS风险值,若评估风险等于或高于截断值1/270，为筛查高风险，需行羊水穿刺；若风险介于1/270～1/1 000，为临界风险，需行羊水穿刺或无创产前筛查；若风险低于1/1 000，则为低风险，需后续观察，做好妊娠随访。

AFP主要来源于胎儿肝脏和卵黄囊,由胎肝细胞合成,胎儿血中AFP通过被动传递方式进入母血和羊水。母血中AFP在妊娠15周开始上升,孕32～34周达到高峰。若胎儿神经管发育异常,致使更多AFP进入羊水，则AFP异常升高。DS胎儿由于肝脏发育不成熟,AFP合成减少,所以母血中含量相应下降。本研究将AFP DBS作为干血斑产前筛查的指标之一，其原理与血清学相同[8]。

绒毛促性腺激素(hCG)由a和β两个亚基构成,检测β亚基可避免交叉反应,能更好地反映胎盘功能及胎儿状况。大约1%的β亚基以游离形式存在。hCG受精后进入母血并快速增殖至孕8周,随后浓度逐渐降低至孕18～20周并保持稳定。据报道，总hCG在产前筛查应用中检出率低于free-βhCG[9]。DS患儿的成熟度较正常胎儿晚,虽然妊娠已进入中期,hCG及free-βhCG β仍处于高浓度水平,同时胎盘滋养叶中的巨噬细胞分泌的水解酶将hCG裂解成a、β亚基,DS患儿或胎盘恶性肿瘤母体的水解酶活性增加,使free-βhCG β浓度更高[10]。本研究将free-βhCG DBS作为干血斑产前筛查的指标之一，其原理与血清学相同。

3.2 1963年有研究者首次将干血斑法应用于新生儿先天性代谢性疾病的筛查,此后干血斑法由于其优势及可行性广泛应用于其他领域,如药物代谢、病毒快速诊断等大规模筛查,是一项应用较为成熟的方法[11-13]。近年来,由于PCR等微量扩增及检测技术的进步,干血斑的应用更取得了长足进步。

干血斑DS产前筛查的优势如下：(1)标本采集简便。血斑法采用DIFF-SAFE将血斑均匀滴注至血片,自然晾干，采血量少，简化了血清学离心、血清分离等步骤,减少了血清处理过程中病毒感染传播的风险[14]。据报道，人类免疫缺陷病毒(HIV)-1、HIV-2、丙型肝炎病毒等在血斑自然干燥过程中已丧失传染性,但某些高滴度病毒(如HBV)即使在干血斑中也能存活7 d[15]；(2)经济学优势。干血斑血液采集简便,转运仅需密封袋密闭或邮寄,降低了血清学方法冷链运输的费用,适于偏远地区普及筛查度；(3)干血斑有利于检测物质保存。如AFP DBS血斑可在37 ℃密封保存1个月，4 ℃保存半年。free-βhCG DBS血斑可在4 ℃保存1 d,-20 ℃保存131年。但高温过高稳定性下降,据报道若温度高于30 ℃，则AFP DBS 的保存不超过24 h。free-βhCG DBS于20 ℃可保存87.3 h，30 ℃以上保存不超过6 h[16-20]。

MOM值是该指标实际测定的浓度值与同孕周健康人群中位数之比，体现了测定值偏离正常值的程度和方向。若系统长期保持稳定，中位数设置准确合理，MOM值应趋于1.0左右波动，假阳性率和检出率波动不大；若系统发生调整，中位数设置不准确，则MOM值将逐渐偏离1.0，降低筛查效率。本研究中，MOM的正常参考范围分别为AFP DBS介于0.7～2.5 MOM，free-βhCG DBS介于0.25～2.5 MOM。当AFP DBS≥2.5 MOM时，筛查结果为ONTD高风险；当free-βhCG DBS≥2.5 MOM时，筛查结果为DS高风险；当free-βhCG DBS<0.25时，常导致ES高风险。表2中各孕周free-βhCG DBS的MOM值稳定在1.0左右波动，而AFP DBS的MOM值较1.0偏大，检查筛查过程，彻底清洁打孔钳，充分晾干后，于血斑中心至边缘1/2处打孔，消除新生儿AFP暂时性增高，不同打孔部位血斑浓度差异等因素的影响。积累大量数据后，调整各项指标MOM值，建立甘肃地区正常孕妇干血斑中孕期浓度的平均水平，合理修正中位数曲线标准，优化实验流程，提高检出率和筛查效率。同时，绘制实验室室内质控，每批实验free-βhCG DBS的变异系数(CV)值均低于5%，AFP DBS的CV值均低于10%，符合“新生儿筛查技术规范”中要求的CV值低于10%，证明实验稳定性强，free-βhCG DBS指标的稳定性优于AFP DBS。

3.3 目前我国城市居民产前筛查的覆盖率仅为30%,而中小城市及偏远地区未能实现DS产前筛查的普及。因此,寻找一种方便快捷、切实可行的筛查方法,对降低我国出生缺陷势在必行。本研究中干血斑DS产前筛查的总阳性筛查率为8.4%，假阳性率较高。经妊娠随访后，确诊8例阳性，其中5例为年龄高风险，与高龄是DS发病的主要因素相吻合。同时，筛查结果为高风险孕妇中确诊21-三体胎儿5例，18-三体胎儿1例，超雌胎儿1例，克氏综合征1例；筛查低风险孕妇中至今无DS、ES及ONTD患儿出生。由于Life Cycle软件自带的中位数值来自于高加索人群干血斑浓度,与本研究人群存在地域及人种等方面的差异,且本研究的样本量不大，可能产生MOM值偏移。据此，在今后的研究中应扩大样本量，获取大样本的本地中位数值,使MOM值分布为中值和众数均接近1的单峰分布,从而找出最佳中位数的拟合曲线,建立更适合本地人群的风险截断值，优化干血斑产前筛查体系,加大产前筛查在我国的普及力度。

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Analysis on results of middle pregnancy dried blood spots prenatal screening among pregnant women in Gansu area

LIUFurong,HAOShengju△,WANGXing,ZHENGLei,YANYousheng

(MedicalGeneticCenter,GansuProvincialMaternityandChildHealthCareHospital,Lanzhou,Gansu730050,China)

Objective To evaluate the risk of Down′s syndrome(DS),Edward′s syndrome(ES) and open neural tube defect (ONTD) at the second-trimester by detecting the concentrations of AFP and free-βhCG in dried blood spots (DBS).Methods The concentrations of AFP and free-βhCG in DBS were quantitatively determined by using time-resolved fluorescence method.The risk was calculated by adopting the Life cycle 3.2 software.Results Among 5 001 screened pregnant women,65 cases were advanced age pregnant women,accounting for 1.3%.The positive screening rates of DS,ES and ONTD were 3.7%(185/5 001),0.4%(20/5 001) and 4.3%(215/5 001) respectively.Eight cases were confirmed positive,in which 5 cases were advanced age pregnancies.Conclusion Second-trimester DBS for screening DS has an important significance in realizing the uniform management of quality control,increasing the screening coverage degree and reducing birth defects.

second-trimester; Down syndrome; dried blood spots prenatal screening

刘芙蓉，女，技师，主要从事医学分子生物学研究。△

，E-mail:76108060@qq.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.016

A

1673-4130(2016)24-3426-04

2016-09-01

2016-10-20)