不同乳汁成分乙型肝炎病毒DNA定量检测的结果分析*

汪东剑，余维涛，刘冬萍，张晓云，邱华琴，刘 仙

(中国人民解放军第一八四医院输血科，江西鹰潭 335000)



·论 著·

不同乳汁成分乙型肝炎病毒DNA定量检测的结果分析*

汪东剑，余维涛Δ，刘冬萍，张晓云，邱华琴，刘 仙

(中国人民解放军第一八四医院输血科，江西鹰潭 335000)

目的 分析不同乳汁成分中乙型肝炎病毒(HBV)-DNA定量检测的结果，为乳汁标本HBV-DNA检测提供参考和依据。方法 对152例乙肝产妇乳汁分别选用混匀乳汁、乳酪、乳清和沉淀进行HBV-DNA定量检测。结果 选用不同的检测对象时，HBV-DNA检测的阳性率差异无统计学意义(χ2=0.437，P=0.933)；HBV-DNA载量间差异有统计学意义(F=2.835，P=0.043)，沉淀中HBV-DNA载量高于乳清中HBV-DNA载量；两两比较后，混匀乳汁、乳酪、乳清间检测结果差异无统计学意义(P>0.05)，混匀乳汁、乳酪、沉淀间检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。结论 对乳汁标本进行HBV-DNA定量检测时，混匀乳汁可能是更为适合的检测对象。

乳汁； 乙型肝炎病毒； DNA

乙型肝炎病毒(HBV)可以通过血液、唾液、乳汁等传播，母婴传播是HBV传播的重要途径。利用血清HBV-DNA定量检测体系对乳汁标本HBV-DNA进行检测已经广泛用于临床和试验研究[1-3]。乳汁是一种较为特殊的体液，经过自然沉淀或离心后形成以乳酪、乳清和沉淀为主的3种成分，在乳汁HBV-DNA检测中，不同的学者所选取乳汁成分各不相同，多以乳清或者沉淀为对象进行检测[4-6]。目前尚少见使用不同乳汁成分进行HBV-DNA检测结果一致性方面的报道，故对于不同学者间的研究成果是否具有可比性存在疑虑。作者在将高载量HBV-DNA阳性定值血清掺入阴性乳汁建立的自制HBV-DNA阳性乳汁模型中发现，同一样品不同乳汁成分中检测出的HBV-DNA载量并不一致[7]。由于该模型中HBV-DNA是外来掺入乳汁中，与真实乳汁中HBV-DNA的存在形式和分布情况可能存在差异，为此本文对152例产妇乳汁标本选用不同成分作为研究对象进行HBV-DNA定量检测，通过比较和分析检测结果，试图发现不同乳汁成分HBV-DNA检测规律，为临床和科研工作中选用适当的乳汁成分进行HBV-DNA检测提供依据和参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2014年10月至2015年12月于本院妇产科分娩，根据2000年全国病毒性肝炎学术会议修订的《病毒肝炎防治方案》诊断标准确诊的152例乙肝产妇，年龄18～39岁，平均(26.07±4.81)岁。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理 产后待初乳分泌后，无菌操作采集3～4 mL乳汁于无菌干燥试管密封后-20 ℃保存待检。

1.2.2 乳汁不同成分的HBV-DNA检测 将收集到的待检乳汁标本按检测对象不同分为混匀乳汁组、乳酪组、乳清组、沉淀组，各组HBV-DNA载量检测按以下方法进行：(1)以混匀乳汁作为检测对象：将乳汁标本充分混匀后，取乳汁200 μL，加入450 μL DNA提取液和4 μL内标溶液，震荡混匀15 s，瞬时离心数秒后，于100 ℃干式恒温器处理10 min，12 000 r/min离心5 min备用；取上清液20 μL加入HBV-PCR反应管12 000 r/min离心数秒后上机扩增。(2)以乳酪、乳清、沉淀作为检测对象：将乳汁标本3 000 r/min离心10 min，分别取乳酪层、中间乳清层、底部沉淀各200 μL，加入450 μL DNA提取液和4 μL内标溶液，震荡混匀15 s，瞬时离心数秒后，于100 ℃干式恒温器处理10 min；12 000 r/min离心5 min备用；取上清液20 μL加入HBV-PCR反应管12 000 r/min离心数秒后上机扩增。(3)结果分析按试剂盒操作说明书进行。

1.3 仪器与试剂 HBV-DNA核酸定量检测使用中山大学达安基因股份有限公司生产的DA-7600核酸扩增仪及其配套HBV-DNA核酸定量检测试剂盒。

2 结 果

2.1 不同乳汁成分HBV-DNA检测结果 152例乙肝产妇乳汁HBV-DNA检测阳性率见表1，不同乳汁成分HBV-DNA检测阳性率间差异无统计学意义(χ2=0.437，P=0.933)。所有乳汁成分HBV-DNA检测均为阳性者共22例，其不同成分HBV-DNA载量检测结果见表1。对4种乳汁成分HBV-DNA载量结果进行方差检验，结果显示4种乳汁成分中HBV-DNA检测结果间差异有统计学意义(F=2.835，P=0.043)。

表1 乳汁不同成分HBV-DNA检测结果

注：*表示所有成分HBV-DNA检测均为阳性的22例乳汁标本。

2.2 乳汁HBV-DNA载量分布情况 乳汁标本中，不同成分HBV-DNA载量分布情况见表2，比较不同乳汁成分中HBV-DNA载量的分布情况发现，差异无统计学意义(χ2=8.499，P=0.204)。

表2 乳汁HBV-DNA载量分布情况[n(%)]

3 讨 论

由于HBV-DNA定量检测试剂盒说明书中，并未对乳汁标本的检测事项进行说明，虽然在《实时荧光PCR技术》中对于乳汁中布鲁菌和分枝杆菌DNA的提取分别选用乳汁整体和重悬后的沉淀作为对象[8]，但也未明确乳汁中HBV-DNA的提取方法，这使得多数学者在对乳汁标本进行HBV-DNA检测时，对选择检测对象缺乏有效的参考，也有不少学者尝试对乳汁标本进行前处理使其更适用于血清HBV-DNA检测体系[9-10]。乳汁分泌后作为一种浑浊非匀质液体，需要检测的是能代表其整体的HBV-DNA载量，本文之所以对乳汁进行离心选用乳清或者沉淀作为检测对象，多数是基于提高检测的准确性和阳性率的考虑。

在本研究中，使用混匀乳汁、乳酪、乳清、沉淀作为检测对象时，HBV-DNA检测的阳性率间差异无统计学意义(χ2=0.437，P=0.933)，乳汁中不同成分HBV-DNA载量的分布情况间的差异也无统计学意义(χ2=8.499，P=0.204)。阳性乳汁中检测出的HBV-DNA载量分布在102～106IU/mL；但在乳清与沉淀中HBV-DNA载量的分布差异有统计学意义(χ2=7.234，P=0.007)：乳清中HBV-DNA载量主要分布在102～104IU/mL，沉淀中HBV-DNA载量主要分布在104～106IU/mL。

通过对4种乳汁成分HBV-DNA载量进行方差分析，发现检测结果间差异有统计学意义(F=2.835，P=0.043)。为确定哪些成分的检测结果不同，本文继而进行SNK检验，结果显示：(1)混匀乳汁、乳酪、乳清间的检测结果差异无统计学意义(P>0.05)；(2)混匀乳汁、乳酪、沉淀间的检测结果差异无统计学意义(P>0.05)；(3)乳清与沉淀间的检测结果差异有统计学意义(P<0.05)，沉淀检测结果高于乳清检测结果。造成这一现象的原因考虑是因为乳汁中HBV-DNA主要以游离或物理吸附的形式存在于乳汁悬液和脂肪颗粒、沉淀物表面，通过离心病毒颗粒更多地吸附于沉淀或者脂肪颗粒表面，从而使得乳清中病毒颗粒的载量小于等体积沉淀中的载量；而这种物理吸附导致的差异幅度较小，使得乳清与混匀乳汁、沉淀与混匀乳汁中的HBV-DNA载量间差异无统计学意义(P>0.05)。从定量检测结果和阳性率来看，混匀乳汁与乳清、混匀乳汁与沉淀间的差异均无统计学意义(P>0.05)，而其更能代表乳汁整体的情况，并且以乳汁整体作为检测对象已被用作布鲁菌中HBV-DNA检测的经典方法，因此考虑是否将混匀乳汁作为乳汁标本HBV-DNA检测的对象更为合适。

实际上乳汁经离心或静置后形成乳酪、乳清、沉淀三层，这三层并非由单一的组分组成，本文将上述三层分别转移至新的离心管后再次离心发现依然会形成乳酪、乳清和沉淀三层，说明简单的离心并不能将乳汁中的乳酪、乳清、沉淀严格地区分出来。以乳清作为检测对象的优势在于缺少了大多数脂肪颗粒和沉淀的影响，更接近于血清的物理形态，可能减少脂类、大颗粒物质对HBV-DNA提取和扩增的抑制作用。但在研究中发现，乳清中HBV-DNA的检测结果、阳性率与混匀乳汁间差异无统计学意义(P>0.05)，说明乳清并不比混匀乳汁作为检测对象有明显优势。以沉淀作为检测对象主要是参考分枝杆菌中HBV-DNA提取方法，期望通过离心能使得乳汁中HBV-DNA主要富集在沉淀中，从而提高检测的阳性率。然而本研究发现经过离心后，沉淀中HBV-DNA检测的阳性率并不高于混匀乳汁，定量检测结果与混匀乳汁间的差异也无统计学意义(P>0.05)。以乳酪作为检测对象进行HBV-DNA检测很少见于报道，绝大多数学者都是采用弃上层脂质，取乳清/沉淀进行HBV-DNA检测，这是基于大家普遍认为乳酪中的大量的脂类将会对HBV-DNA检测造成较为明显的抑制作用。在本研究中却发现，乳酪中不仅能够检测出HBV-DNA，而且与其他乳汁成分相比HBV-DNA检测阳性率、检测结果间的差异无统计学意义(P>0.05)。不过，依然不建议将乳酪作为HBV-DNA的检测对象，因为：(1)乳酪容易吸附在微量吸嘴内壁及外壁，使得其存在加样不准确的可能，从而影响检测结果的准确性和重复性；(2)吸取乳酪时难免会混入部分乳清，使得检测结果并不能完全代表乳酪中HBV-DNA的载量情况。本文建议将混匀乳汁作为乳汁中HBV-DNA检测对象基于以下考虑：(1)方法简单，无需离心或者自然沉淀的过程；(2)将乳汁成分可能对HBV-DNA检测的影响均匀分摊，使其检测结果与真值间的差异不会过大；(3)尽量使HBV-DNA在乳汁中分布均匀，从而使得检测结果更能代表乳汁中HBV-DNA载量的真实情况；(4)加样准确，不易因加样误差而影响检测结果。

乳汁标本中HBV-DNA定量检测方法的标准化还有许多问题需要解决。本次研究的结果仅能反映出乳汁中不同成分HBV-DNA检测结果间的差异，由于缺乏专用的乳汁HBV-DNA检测质控品，使得对于检测出的不同乳汁部分中HBV-DNA结果的准确性缺乏判断依据。同时，由于本次研究中HBV-DNA阳性乳汁例数较少，乳汁中不同成分HBV-DNA检测结果的差异仍需要通过更多标本的检测、更完善的试验设计来探讨和研究。

[1]张静,黄晨艳.553例产妇血清、乳汁、唾液中乙型肝炎病毒-DNA载量的检测及相关性研究[J].实用妇产科杂志,2012,28(4):294-297.

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Analysis of hepatitis B virus DNA quantitative detection results in different breast milk compositions*

WANGDongjian,YUWeitaoΔ,LIUDongping,ZHANGXiaoyun,QIUHuaqin,LIUXian

(DepartmentofBloodTransfusion,184HospitalofPLA,Yingtan,Jiangxi335000,China)

Objective To analyze the results of hepatitis B virus(HBV)-DNA quantitative detection in different breast milk components to provide reference and basis for the HBV-DNA quantitative detection of breast milk sample.Methods The HBV-DNA in the blending milk,cheese,whey and precipitation in 152 hepatitis B parturients was quantitatively detected.Results When choosing different detect objects,there was no statistically significant difference in HBV-DNA detection positive rate(χ2=0.437，P=0.933)；the difference in HBV-DNA loads was statistically significant(F=2.835,P=2.835),the HBV-DNA loads in precipitation was higher than that in whey.There was no statistical significant difference in the pairwise comparison of the test results of blending milk,cheese and whey;also the difference of test results among blending milk,cheese and precipitation was not statistically significant(P>0.05).Conclusion In the HBV-DNA quantitative detection of breast milk sample,the blending milk may be more suitable detection object.

breast milk; hepatitis B virus; DNA

南京军区医学科技创新课题资助项目(MS078)。

汪东剑，男，副主任技师，主要从事临床检验与输血研究。△

，E-mail:dearwdj@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.24.007

A

1673-4130(2016)24-3403-03

2016-09-05

2016-10-24)