孕烯醇酮衍生物体外抗癌活性研究*

耿晓宇，于春影，王艳秋

(1.通化师范学院制药与食品科学学院，吉林通化134002;2.江苏豪森药业股份有限公司，江苏连云港224200; 3.通化市卫生学校，吉林通化134002)

孕烯醇酮衍生物体外抗癌活性研究*

耿晓宇1，于春影2，王艳秋3

(1.通化师范学院制药与食品科学学院，吉林通化134002;2.江苏豪森药业股份有限公司，江苏连云港224200; 3.通化市卫生学校，吉林通化134002)

目的:研究孕烯醇酮衍生物的体外抗癌活性.方法:采用MTT活细胞染色法，对3个孕烯醇酮衍生物进行了PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞体外增殖抑制实验.结果:3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸(A2)具有较好的抗癌活性.结论:孕烯醇酮衍生物的抗癌活性值得进一步研究.

3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸甲酯;3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸;孕烯醇酮衍生物;抗癌活性;MTT法

1 引言

2008年刘跃金等［1］报道了3β，5α，6β－三羟基胆－24－酸甲酯、胆甾－3β，5α，6β－三醇对小鼠肉瘤S180有一定的体内抗癌活性.2011年，Carvalho JFS等［2］进行了HT－29等7个瘤株的体外抗癌活性筛选，表明3β，5α－二羟基胆甾－6－肟、6β－甲氧基胆甾－3β，5α－二醇、胆甾－3β，4 β，5α，6β－四醇和6β－乙酰氧基胆甾－3β，5α－二醇均具有较好的体外抗癌活性.2013年Wang P等［3］在中国南海从柳珊瑚Menella kanisa中分离得到麦角甾 －3β，5α，6β－三醇、胆甾 －3β，5α，6β－三醇等27个甾体化合物，对人肺癌A549细胞具有不同的抗癌活性.同年，Liu TF等［4］在中国南海从柳珊瑚中分离得到胆甾－1β，3β，5α，6β－四醇，对A549和MG－63表现出较好的抗癌活性，并能诱导A549细胞凋亡.2016年，张杨梅［5］等在中国南海红树林底泥的海洋链霉菌 H41 －59发酵物中的次级代谢产物中分离得到10个甾醇类化合物，发现麦角甾－8(9)，22－二烯－3β，5α，6β，7α－四醇、麦角甾－8(14)，22－二烯－3β，5α，6β，7α －四醇对人肺癌细胞 NCIH460、人乳腺癌细胞MCF－7和人神经胶质瘤细胞SF－268具有较好的抑制活性.

PC－12细胞是从大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤克隆的细胞系，主要分泌产物为儿茶酚胺类递质，因其具有可传代培养的特点，广泛用于神经生理、病理及药理方面研究，有助于阐明神经系统疾病的发病机制、药物疗效，探索新的药物与治疗手段［6］.

本文研究了3个孕烯醇酮衍生物对PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞的生长影响，进行了体外抗癌活性筛选，以期获得较好活性的甾体化合物.

2 材料与仪器

孕烯醇酮衍生物:3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸(A2)和3β，5α，6β－三羟基孕甾－20－酮(A3)含量皆为质量分数≥99%(沈阳化工大学制药与生物工程学院提供);RPMI1640培养基(美国Gibco公司);四季青小牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司);其他试剂，分析纯(天津市博迪化工有限公司);PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(中国科学院上海生科院细胞资源中心).

北京普郎DNM－9602G酶标仪，北京仪和方圆科技有限公司;INC02－108 CO2培养箱，德国Memmert公司等.

图1 孕烯醇酮衍生物的结构式

3 实验方法

PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞MTT活细胞染色法体外增殖抑制实验取生长状态良好的PC －12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，接种于含质量浓度为10%小牛血清培养液，配制成单个细胞悬液，接种于96孔板，每孔5～50个悬浮细胞·L－1，体积200μL.置37℃、CO2为体积分数5%培养箱培养约4d.每孔加5mg·L－1MTT 150μL，摇床振荡15min以充分溶解结晶物.在570nm用酶标仪测定各孔吸光度.

收集处于对数增长期的PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞，然后用质量浓度25%的胰酶消化，再以RPMI1640培养液稀释至1×106个悬浮细胞·L－1.在96孔培养板每孔接种100μL，置培养箱内调温度至37℃、CO2为体积分数5%，培养24h.弃培养液，以磷酸盐缓冲液洗两次.样品精密称定，以二甲基亚砜助溶，加磷酸盐缓冲液稀释，每孔加入的终浓度为 0.012、0.024、0.048、0.096、0.192、0.384mmol·L－1培养20h.每孔加5mg·L－1MTT 20μL继续培养4h后，弃培养液，每孔加入二甲基亚砜150μL，振荡15min.在570nm用酶标仪测定各孔吸光度.抑制率=(1－加药组吸光度值/对照组吸光度值)*100%，采用数据处理软件SPSS 19.0计算IC50值.

4 实验结果

(1)以浓度(x，mmol·L－1)为横坐标，细胞抑制率(%)为纵坐标，绘制三种物质的浓度——细胞抑制率曲线如图2－4所示.

图2 3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1) 对PC－12细胞抑制率曲线

图3 3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸(A2) 对PC－12细胞抑制率曲线

图4 3β，5α，6β－三羟基孕甾－20－酮(A3) 对PC－12细胞抑制率曲线

(2)IC50值

表1 化合物A1－A3对PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞体外IC50值

4 讨论与结论

目前，恶性肿瘤的治疗方法仍然是以手术、化疗、放疗为主的综合治疗.临床常用的化疗药物主要是通过细胞毒作用杀伤肿瘤细胞，但由于大多数化疗药物毒性大，许多患者难以承受［7］.需要研制新抗肿瘤药以提高疗效，降低毒副作用，提升病人的生活质量.近年来发现很多甾体化合物具有抗肿瘤活性，而且毒副作用小.

半数抑制浓度(IC 50)是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度，是标志药物效应的一种重要定量指标.本实验用MTT活细胞染色法研究了不同浓度的3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸(A2)、3β，5α，6β－三羟基孕甾－20－酮(A3)对PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞的生长影响.3种药物IC50值分别为0.0814mmol·L－1、0.0977mmol·L－1、0.2132mmol·L－1，对PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞都有一定抑制作用.

3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸甲酯(A1)、3β，5α，6β－三羟基雄甾－17β－羧酸(A2)、 3β，5α，6β－三羟基孕甾－20－酮(A3)对PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞体外活性研究未见报道.本实验研究发现(A1)、(A2)对PC－12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤的活性较好，值得进一步进行药效学、毒理、作用机制等研究.另外，孕烯醇酮衍生物与现有的抗癌药物联合使用增加治疗效果也是下一步所追求的目标.

［1］刘跃金，耿晓宇，王晶明，等.羟基胆烷酸类和羟基胆甾烷类化合物的体内抗癌活性［J］.中国现代应用药学，2008，25(7):601－604.

［2］CARVALHO JFS，SILVA MMC，MOREIRA JN，et al.Selective cytotoxicity of oxysterols through structural modulation on rings A and B.synthesis，in vitro evaluation，and SAR［J］.Journal of Medicinal Chemistry，2011，54(18):6375－6393.

［3］WANG P，TANG H，LIU BS，et al.Tumor cell growth inhibitory activity and structure activity relationship of polyoxygenated steroids from the gorgonian Menella kanisa［J］.Steroids，2013，78(9):951－958.

［4］LIU TF，LU X，TANG H，et al.3β，5α，6β－Oxygenated sterols from the South China Sea gorgonian Muriceopsis flavida and their tumor cell growth inhibitory activity and apoptosis－inducing function ［J］.Steroids，2013，78(1):108－114.

［5］张杨梅，李先盛，李红玉，等.海洋链霉菌H41－59甾醇类化学成分及其细胞毒活性研究［J］.天然产物研究与开发，2016，28 (5):690－695.

［6］Mouri K，Sako Y.Optimality conditions for cell－fate heterogeneity that maximize the effects of growth factors in PC12 cells［J］.PLoS Comput Biol，2013，9(11):e1003320.

［7］Zhang HT，Luo H，Wu J，et al.Galangin induces apoptosis of hepatocellular carcinoma cells via the mitochondrial pathw ay［J］.World J Gastroenterol，2010，16:3377－3384.

(责任编辑:王海波)

O626.21

A

1008－7974(2016)06－0058－03

10.13877/j.cnki.cn22－1284.2016.12.018

2016－10－25

耿晓宇，辽宁庄河人，硕士研究生，助教.