嗜铬细胞瘤生物学行为预测的演变

祝宇 蒋文 林登强

嗜铬细胞瘤是一种起源于肾上腺髓质或交感神经副神经节嗜铬组织的肿瘤，能自主合成并分泌儿茶酚胺类激素，并引起包括高血压、心律失常等在内的多种严重并发症。由于嗜铬细胞瘤病因复杂，迄今尚没有统一的金标准来准确地预测嗜铬细胞瘤的良恶性潜能。2004年世界卫生组织(WHO)曾根据肿瘤是否发生远处转移，将嗜铬细胞瘤分为恶性嗜铬细胞瘤和良性嗜铬细胞瘤，后来发现该标准存在明显的局限性，一些诊断为良性嗜铬细胞瘤的患者，在经过一段时间的治疗和随访后常会出现复发和转移，而未能得到及时的治疗。因此，2017年最新的WHO指导意见取消了嗜铬细胞瘤的良、恶性分类，将嗜铬细胞瘤分为转移性嗜铬细胞瘤和非转移性嗜铬细胞瘤，并认为所有嗜铬细胞瘤都具有一定的恶性潜能[1-2]。目前嗜铬细胞瘤的生物学行为预测主要根据临床表现及生化、影像学、病理学、分子生物学检测等来综合判断，缺少预测的金标准，这给嗜铬细胞瘤的治疗与随访带来了一定挑战。

一、生化检查

儿茶酚胺类激素是酪氨酸经由酪氨酸羟化酶、芳香族氨基酸脱羧酶和多巴胺羟化酶等催化生成的。常见的儿茶酚胺类激素及其代谢产物包括去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、肾上腺素(epinephrine, E)、多巴胺(dopamine, DA)、甲氧基肾上腺素类物质(metanephrines, MNs)、甲氧酪胺和香草基扁桃体酸(vanillylmandelic acid, VMA)等。不同分化程度的嗜铬细胞瘤的瘤体内参与儿茶酚胺类激素合成和代谢酶的种类存在明显差异，因此不同生物学行为的嗜铬细胞瘤有着不同的儿茶酚胺类激素合成与代谢模式，通过检测尿液或血清中儿茶酚胺类激素的代谢产物是一种重要的嗜铬细胞瘤生物学行为预测方法[3]。研究发现，恶性嗜铬细胞瘤多巴胺羟化酶异常升高，DA代谢速度相较于良性嗜铬细胞瘤明显增快，导致DA的下游代谢产物NE的异常堆积，因此恶性嗜铬细胞瘤患者血浆NE水平常明显升高，E/(E+NE)比值也低于良性嗜铬细胞瘤[3-4]。但血浆儿茶酚胺类激素常受药物、食物和生理状态的影响，而尿液成分受外界因素干扰较少，因此尿液中儿茶酚胺类激素诊断的稳定性相对较高。除此之外，其他代谢物的生化检查对嗜铬细胞瘤生物学行为的预测也有一定的帮助，我院在一项包含136例嗜铬细胞瘤的研究中发现，MNs和VMA也是反映嗜铬细胞瘤分化程度的重要指标，恶性嗜铬细胞瘤患者血浆和尿液MNs水平均高于良性嗜铬细胞瘤患者(P<0.001)[5]。综上，血浆和尿液的生化检查是一种简便、经济的嗜铬细胞瘤筛查方法，运用不同的代谢物组合能大大提高诊断的敏感性和特异性。

二、影像学检查

对内分泌检查存在异常的患者，常需要影像学检查手段来确定嗜铬细胞瘤原发和转移部位。CT和MRI是最常用的定位检查方法，CT能够发现0.5～1.0 cm以上原发病灶和1～2 cm以上的转移病灶，肿瘤可表现为密度不均、坏死、出血、囊性变、钙化，CT发现原发病灶和转移病灶的敏感性分别为93%～100%和90%，但特异性仅为50%；儿童、孕妇以及对造影剂过敏者推荐使用MRI检查，MRI发现原发病灶和转移病灶的敏感性和特异性与CT检查相似，嗜铬细胞瘤具有丰富的血供，肿瘤T1WI多呈低信号、T2WI呈高信号[6]。间碘苄胍(metaiodoenzylguanidine, MIBG)是一种NE类似物，可被嗜铬细胞瘤的细胞囊泡摄取，在解剖学成像阴性而怀疑嗜铬细胞瘤或者高度怀疑恶性嗜铬细胞瘤时，可行同位素标记的131I或123I-MIBG核素显像，两者的诊断敏感性分别为77%～90%、83%～100%[7]。但在Ilias等[8]进行的一项包含16例恶性嗜铬细胞瘤的研究中，仅9例131I-MIBG核素显像为阳性，诊断敏感性为56%，而行18F-脱氧葡萄糖(gluorodeoxyglucose, FDG)扫描时，16例均发现阳性放射性核素浓聚，提示在131I-MIBG阴性尚不足以排除嗜铬细胞瘤恶性生物学行为潜能时，可进一步行其他非特异性核素扫描(18F-FDG、111In-奥曲肽等)[9]。

三、病理学检查

病理学一直是肿瘤诊断的金标准，然而到目前为止还没有统一的诊断标准应用于嗜铬细胞瘤的病理学检查中。在2004年WHO提出根据肿瘤的转移情况将嗜铬细胞瘤分为良恶性之前，主要是综合肿瘤的定位、体积、重量、融合性坏死、有丝分裂数、脂肪浸润、血管与包膜侵犯和复发等情况来预测嗜铬细胞瘤的生物学行为，然而这些并非是区分嗜铬细胞瘤良恶性潜能的有效指标[10-11]。Goldstei等[12]研究发现14例嗜铬细胞瘤患者的组织病理学显示存在血管和包膜侵犯且高度怀疑为恶性嗜铬细胞瘤，然而随访11.5年仅有1例发生远处转移。同样地，Wailly等[13]研究发现肿瘤直径越大，嗜铬细胞瘤恶性潜能越高，而另外两项研究[10,14]发现肿瘤直径与嗜铬细胞瘤生物学行为无明显相关性。经验告诉我们，单一指标并不能完全预测嗜铬细胞瘤的生物学行为，有病理学家提出以多项病理、内分泌指标为基础，赋予这些指标以不同的评分权重，综合评分以提高肿瘤良恶性鉴别诊断的特异性，目前常用的评分系统有PASS(pheochromocytoma of the adrenal gland scaled score)评分系统和GAPP(grading system for adrenal phaeochromocytoma and paraganglioma)评分系统[11,15]。PASS评分系统是由美国病理学家Thompson在2002年提出的[11]，并于2004年纳入到WHO内分泌肿瘤的诊疗蓝皮书中，PASS评分系统主要由12项病理学指标构成：①包膜侵犯(1分)；②血管侵犯(1分)；③周围脂肪浸润(2分)；④大癌巢或弥漫性生长(>10%肿瘤体积)(2分)；⑤中央坏死(大癌巢中央)或融合性坏死(2分)；⑥多细胞性(2分)；⑦纺锤样肿瘤细胞(2分)；⑧细胞单一性(2分)；⑨有丝分裂增多(>3/10 HPF)(2分)；⑩非典型有丝分裂象(2分)；核异型性增多(1分)；核深染(1分)，总分<4分为良性，≥4分为恶性。然而PASS评分系统却因其可靠性、可重复性差未被广泛采用，Wu等[16]采用盲法让5位病理学家对57例嗜铬细胞瘤患者的病理切片进行PASS评分，6个月后让其中2位病理学家对该组切片再次进行PASS评分，结果发现对于同一病例5位病理学家未能得出相同的评分，且同一病理学家对同一病例在不同时间的PASS评分也存在较大差异，反映出不同病理学家对PASS评分系统各指标的概念理解、尺度把握上存在差异。另外，Kulkarni等[17]通过观察6例嗜铬细胞瘤病例发现，PASS评分>6分者均为恶性嗜铬细胞瘤，<6分者均为良性嗜铬细胞瘤，提示PASS评分以4分界定嗜铬细胞瘤的良恶性缺少客观依据，需要更大样本来验证。嗜酪蛋白A(chromogranin A, CgA)是一种位于分泌囊泡上的糖蛋白，神经内分泌细胞及肿瘤能够特异性的表达CgA，Bílek等[18]发现血浆CgA水平与PASS评分呈正相关，同时与肿瘤的体积及恶性程度有一定的相关性。由于PASS评分系统重复性较差，日本学者Kimura等[15]提出了综合肿瘤组织病理和内分泌生化检查的GAPP评分系统，由6大类指标构成：①组织类型：器官样结构(0分)、大小不规则癌巢(1分)、假菊形结构(1分)；②细胞数：低(<150个/HPF)(0分)、中(150～250个/HPF)(1分)、高(>250个/HPF)(2分)；③粉刺样坏死：无(0分)、有(2分)；④血管或包膜侵犯：无(0分)、有(1分)；⑤Ki-67指数：<1%(0分)、1%～3%(1分)、>3%(2分)；⑥儿茶酚胺类型：肾上腺素型(E或E+NE)(0分)、去甲肾上腺素型(NE或NE+DA)(1分)、无功能型(0分)，总分10分，0～2分为高分化，3～6分为中分化，7～10分为低分化。GAPP评分系统取消了肿瘤良恶性的分类，认为所有嗜铬细胞瘤都有恶性潜能，评分越高，分化程度越低，恶性潜能越高，预后越差。GAPP评分系统的优点在于：一方面，提高对某些高分化嗜铬细胞瘤的重视，认为所有嗜铬细胞瘤都具有恶性潜能，这点与最新的WHO指导意见十分相似；另一方面，根据嗜铬细胞瘤的分化程度采用不同的随访方案，大大节约了有限的医疗资源。然而GAPP评分系统还未得到其他研究的验证，未来需要更多的研究去证实。

四、分子生物学

不同于其他肿瘤，在出现特定的病理学改变之前，嗜铬细胞瘤就可出现“关键基因”异常改变，故而仅仅通过病理学来预测嗜铬细胞瘤生物学行为显得十分困难[19]。嗜铬细胞瘤有超过1/3是遗传性疾病引起的，基因分子异常改变是嗜铬细胞瘤的重要特征。常见引起嗜铬细胞瘤的遗传性疾病包括多发性内分泌腺瘤综合征2型(multiple endocrine neoplasia 2, MEN2)、家族性脑视网膜血管瘤、神经纤维瘤病1型(neurofibromatosis type 1, NF1)和家族性嗜铬细胞瘤/副神经节瘤，这些遗传性疾病都与“关键基因”异常改变有关。随着近年来二代测序、大数据以及生物信息学的迅猛发展，越来越多的“关键基因”被发现与嗜铬细胞瘤的发生、发展密切相关，深入了解这些“关键基因”的具体作用机制可为肿瘤的生物学行为预测提供可能。目前发现与嗜铬细胞瘤密切相关的“关键基因”超过10多个，根据所在通路可将其分为以下3大类[20]。

1.受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTKs)及其下游级联信号：①RET原癌基因是一种跨膜的酪氨酸激酶，RET突变能够诱发下游的PI3K-AKT和MAPK-ERK级联信号过度活化，进而引起细胞过度生长[21]。MEN2是一种由RET原癌基因突变引起的常染色体显性遗传疾病，约有70%～80%的MEN2会伴有嗜铬细胞瘤，MEN2有3个亚型：MEN2A、MEN2B和家族性甲状腺髓样癌，MEN2A是其中最常见类型，最常见引起MEN2A的突变是RET蛋白富含半胱氨酸区域的第10号外显子的609、611、618、620位密码子和第11号外显子的634位密码子突变[21-22]。②NF1基因是一种抑癌基因，能编码肿瘤生长抑制蛋白来抑制RAS-RAF-MAPK通路的激活。NF1是一种由NF1基因突变引起的常染色体显性遗传疾病，其中约0.1%～5.7%会伴有嗜铬细胞瘤，但90%表现为良性潜能[23]。③血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)是一种重要的酪氨酸激酶型受体，本课题组前期研究发现VEGF水平在良恶性嗜铬细胞瘤中有明显差异(P<0.05)，其在恶性嗜铬细胞瘤、良性嗜铬细胞瘤和正常肾上腺髓质组织中的阳性率分别为82.40%、23.80%、5.00%[24]。④MAX和TMEM127是RTKs下游级联信号的重要抑制因子，MAX能抑制原癌基因MYC表达，而TMEM127能抑制细胞生长信号mTOR的过度激活。近年来发现，MAX和TMEM127突变能够引起嗜铬细胞瘤的发生，超过60% MAX突变的嗜铬细胞瘤为双侧或多灶性发生，约2%的嗜铬细胞瘤会有TMEM127突变[22,25]。

2.假性缺氧相关通路：①琥珀酸脱氢酶复合体(succinate dehydrogenase complex, SDHx)是一种位于线粒体内膜的脱氢酶，由4个亚基(SDHA、SDHB、SDHC、SDHD)和共刺激因子(SDHAF2或SDH5)构成，主要参与线粒体呼吸链电子的传递。SDHx突变能促进HIF1α的过度堆积，进而激活下游VEGF过度表达以增强肿瘤的血管生成。家族性嗜铬细胞瘤/副神经节瘤是由SDHx突变引起的一种遗传性疾病，另外约10%散发性嗜铬细胞瘤也会伴有SDHx突变(6% SDHB、4% SDHD)。由Hulsteijn等[26]进行的一项包括12项研究的meta分析显示，恶性嗜铬细胞瘤中分别有17%和8%的患者是SDHB突变和SDHD突变携带者，且SDHB和SDHD突变的嗜铬细胞瘤有大概率转移的可能。②VHL基因是重要的抑癌基因，通过泛素化作用促使HIF1α的降解来抑制肿瘤的血管生成。Von Hippel-Lindau(VHL)病是由VHL基因突变的一种常染色体显性遗传疾病，能够引起包括肾癌、视网膜和中枢神经系统的血管瘤在内的多种疾病，主要分为VHL1型(不伴嗜铬细胞瘤)和VHL2型(伴嗜铬细胞瘤)[27]，其中约5% VHL突变的嗜铬细胞瘤存在恶性潜能[28]。

3.WNT通路：WNT通路对细胞生长与分化的维持起着重要作用，WNT通路异常改变也会导致肿瘤的发生[29]。嗜铬细胞瘤中存在WNT(1.2%)、APC(1.7%)、MAML3(5.2%)和ATRX(2.9%)等[20]在内的多种突变。深入了解嗜铬细胞瘤发生的分子机制对其生物学行为的预测显得尤为必要，系统的基因筛查不仅能提高嗜铬细胞瘤的筛检率，还能为未来的治疗药物研发提供更多的靶点。

嗜铬细胞瘤的生物学行为预测一直是临床诊疗的难点和重点，除了常见的病理学诊断外，仍然缺乏有效的指标去识别肿瘤的生物学行为。对嗜铬细胞瘤良恶性的预测，需要综合生化、影像、病理等结果来进行判断，且长期密切随访也尤为必要。生物大数据的兴起为更多的分子标志提供了可能，也为嗜铬细胞瘤生物学行为预测和诊疗奠定了基础。